PCR là gì? Ứng dụng trong chẩn đoán Y Khoa?

Gần đây, thuật ngữ PCR và RT-PCR được sử dụng rất nhiều, biết đến là phương pháp phát hiện Covid-19, nhưng không hẳn ai cung biết tới nó.

Vậy xét nghiệm PCR là gì? Ứng dụng của nó trong chẩn đoán Y Khoa gồm những gì?
___________________________________________________

?️♀️?️♀️?️♀️ PCR là gì? Lịch sử phát minh ra nó?

? PCR (Chuỗi Phản ứng Polymerase, Polymerase Chain Reaction) là kỹ thuật phát hiện DNA (hoặc RNA) của mầm bệnh hiện diện trong bệnh phẩm nhở vào phản ứng chuỗi enzyme polymerase khuếch đại lên cả triệu lần trong một thời gian ngắn. Nhờ PCR, từ một mẫu rất nhỏ DNA (RNA), như từ một giọt máu, một sợi tóc hay chỉ một tế bào… phòng xét nghiệm có thể nhân lên, phóng đại ra hàng triệu bản cho các quá trình khảo sát, xác định tiếp theo.

? PCR được phát minh bởi Kary Mullis, Công ty sinh học Cetus, Emeryville, California, Hoa Kỳ, năm 1983. Trên Scientific American, Mullis nhận định về kỹ thuật của mình: “Bắt đầu với một phân tử DNA di truyền, PCR có thể tạo ra 100 tỷ phân tử y hệt trong một buổi chiều. Phản ứng rất dễ thực hiện. Nó không cần nhiều hơn một ống nghiệm, một vài thuốc thử đơn giản và nguồn nhiệt”. Và với phát minh quan trọng này, Kary Mullis đã chia sẻ giải thưởng Nobel hóa học với Michael Smith năm 1993.

?️♀️?️♀️?️♀️ PCR vận hành ra sao?

?? Nguyên lý hoạt động của PCR là dùng enzyme trùng hợp polymerase để nhanh chóng tạo ra một lượng lớn các bản sao từ một đoạn AND (ARN) chọn lọc.

?? Quy trình thực hiện PCR qua ba bước chính: biến tính; kết hợp; và mở rộng (extension), lặp lại từ 30-40 chu kỳ. Chu trình được thực hiện trên một máy quay tự động, một thiết bị làm nóng nhanh và làm lạnh các ống nghiệm chứa hỗn hợp phản ứng.

? Biến tính (denaturation) thực hiện ở 94^oC, giúp sợi xoắn kép DNA tách thành hai đoạn DNA chuỗi đơn.

? Ủ kết hợp (annealing) thực hiện ở 54^oC, các cặp mồi kết hợp với “mẫu” chuỗi đơn, enzyme polymerase gắn vào và bắt đầu sao chép mẫu.

? Mở rộng (extension) thực hiện ở 72^oC, polymerase tổng hợp các chuỗi DNA bổ sung cho mẫu được ghép với mồi, tạo ra một phân tử DNA sợi kép.

?? Các chu kỳ được đi lặp lại nhiều lần, nhiều bản sao được tạo ra và số lượng bản sao của mẫu được tăng theo cấp số nhân.

? ? Đặc biệt, với các virus RNA, như HIV, sởi, quai bị, ZIKA… phòng xét nghiệm sẽ dùng enzyme sao chép ngược reverse trancriptase (RT) để biến đổi đoạn RNA của virus thành DNA rồi tiến hành PCR, xét nghiệm này gọi là RT-PCR (Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction). Kỹ thuật này có hai giai đoạn:

? Sự tổng hợp cDNA (DNA bổ sung) từ RNA bằng cách sao chép ngược (RT) và

? Sự khuếch đại của một cDNA cụ thể bằng phản ứng chuỗi polymerase (PCR).

?️♀️?️♀️?️♀️ Những ứng dụng của PCR trong Y Khoa

? Kỹ thuật PCR cho phép con người nhân lên cả triệu đoạn AND (ARN) trong thời gian rất ngắn. Vì thế, hiện nay PCR đã trở thành công cụ thiết yếu cho các nhà sinh học, phòng thí nghiệm pháp y, di truyền… ứng dụng để chẩn đoán bệnh di truyền, xác định vi khuẩn và virus, lấy dấu DNA vân tay, nghiên cứu sự tiến hóa của con người, nhân bản DNA của xác ướp, xác định quan hệ huyết thống hay sinh học.v.v…

? ? ? Riêng trong lãnh vực y tế, PCR giúp chẩn đoán một số bệnh đặc hiệu, liên quan di truyền phân tử mà các phương pháp xét nghiệm truyền thống không thể làm được.Cụ thể xét nghiệm sinh học phân tử PCR và RT-PCR giúp chẩn đoán chính xác các bệnh như:
? Phát hiện các mầm bệnh không thể nuôi cấy thường quy được như các virus (viêm gan B, viêm gan C, Dengue, HIV, Herpes, CMV, EBV, HPV, virus SARS, H5N1…), các vi khuẩn (Chlamydia, Legionella, Mycoplasma, Treponema pallidum…).

? Phát hiện các vi khuẩn bệnh lây tình dục (sex transmitted diseases STDs (Chlamydia, Legionella, Mycoplasma, Treponema pallidum…).

? Phát hiện các tác nhân nuôi cấy thất bại vì ít có mặt trong bệnh phẩm, rất chậm phát triển, hay đã bị điều trị kháng sinh trước đó (lao thất bại nuôi cấy, viêm màng não mủ mất đầu…).

? Phát hiện nhanh các chủng virus Dengue của bệnh sốt xuất huyết.

? Phát hiện mầm mống của bệnh ung thư (HPV trong ung thư cổ tử cung, phát hiện gene APC trong ung thư đại tràng, gene BRCA1, BRCA2 trong ung thư vú, gene TPMT trong bệnh bạch cầu trẻ em, gen Rb-105 trong u nguyên bào lưới, gen NF-1,2 trong u xơ thần kinh, gen IgH và TCRy trong u lympho không Hodgkin…)

? Nghiên cứu về hệ kháng nguyên bạch cầu người (HLA, human lymphocyte antigen)…

? Phát hiện các chủng vi khuẩn kháng thuốc như S.aureus MRSA, các vi khuẩn sinh ESBL betalactamase, hay carbapenemase…)

? Xác định độc tố của vi sinh vật: Tiểu đơn vị A của độc tố ruột không chịu nhiệt của Escherichia coli.

? Trong công nghệ sinh học, xét nghiệm sinh học phân tử PCR được sử dụng trong việc lập bản đồ gen, phát hiện gene, dòng hoá gene, giải mã trình tự ADN…
_________________________________________________
? ? ? Tài liệu tham khảo:
[1] PCR (Polymerase Chain Reaction): https://www.medicinenet.com/pcr_polymerase_chai…/article.htm

[2] PCR in diagnosis of infection: Detection of bacteria in cerebrospinal fluids: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC119969/

[3] How does the PCR work ?: https://www.youtube.com/watch?v=3XPAp6dgl14

[4] Polymerase Chain Reaction (PCR): https://www.youtube.com/watch?v=iQsu3Kz9NYo

[5] Basic Principles of RT-qPCR: https://www.thermofisher.com/…/basic-principles-rt-qpcr.html

[6] Reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR): https://www.khanacademy.org/…/reverse-transcriptase-polymer…

[7] RT PCR (Reverse transcription PCR): https://www.slideshare.net/…/rt-pcr-reverse-transcription-p…

(Theo: TS.BS Trần Bá Thoại – Uỷ viên BCH Hội Nội tiết Việt Nam)