Cách khử nhiễm và loại bỏ dương tính giả trong phản ứng PCR.

Cách khử nhiễm và loại bỏ dương tính giả trong phản ứng PCR.

Phản ứng PCR thường có độ nhạy rất cao, nhưng chính nhược điểm đó lại khiến kỹ thuật này dễ xảy ra dương tính giả. Trong phòng thí nghiệm, nơi chủ yếu thực hiện phản ứng PCR, bất kỳ sự dương tính giả nào cũng có thể thường xuyên xảy ra không chỉ từ việc nhiễm sản phẩm khuếch đại.

Một mao quản bị vỡ hay một khay PCR để bất cẩn ở mép bàn cũng đều khiến phát tán các phân tử sản phẩm khuếch đại. Và sau đó sản phẩm này sẽ luôn hiện lên trong bất kỳ phản ứng PCR nào mà bạn thực hiện. Nếu bạn thường xuyên phải tiến hành phản ứng PCR, thì có lẽ bạn đã hiểu điều mà tôi định nói tới.

Vậy bạn sẽ làm gì để khử nhiễm?

Một cách đơn giản mà hiệu quả để loại bỏ việc nhiễm các sản phẩm khuếch đại là lau sạch tất cả mọi thứ, từ thiết bị, khu vực làm PCR đến pipet với chất tẩy (như Giaven,…). Đúng vậy, thuốc tẩy … chứ không phải là HCl. Nếu bạn thường xuyên sử dụng HCl để khử nhiễm DNA thì chắc chắn bạn cần phải đọc phần bên dưới đây.

Cách hiệu quả để loại bỏ việc nhiễm các sản phẩm khuếch đại là lau sạch tất cả mọi thứ, từ thiết bị, khu vực làm PCR đến pipet với chất tẩy. (Ảnh minh họa: http://homepage.smc.edu/)
Sodium hypochlorite là một thành phần có trong thuốc tẩy, được biết đến vào năm 1992 với tác dụng bảo vệ hiệu quả, chống lại sự nhiễm sản phẩm DNA khuếch đại bằng cách gây ra “extensive nicking”, do đó có khả năng ngăn chặn các đoạn kích thước 600 bp – sản phẩm của phản ứng PCR (xem thêm AM Prince, L. Andrus PCR: BioTechniques 1992 Mar; 12 (3): 358-60).

Ngược lại, một nghiên cứu khác đã chỉ ra rằng thậm chí tận sau 5 phút tiếp xúc với HCl 2N, các đoạn 600bp vẫn được phát hiện bằng PCR. Vì vậy, đã đến lúc bạn nên sử dụng thuốc tẩy thay vì HCl.

Nhưng chúng ta nên sử dụng loại thuốc tẩy nào?

Hiệu quả của thuốc tẩy trong việc khử nhiễm DNA phụ thuộc vào lượng clo tự do có trong thuốc tẩy đó. 0,05-0,5% clo tự do được coi là mức độ khử trùng trung bình và một chất tẩy thương mại (như Clorox) sẽ chứa khoảng 5.84% clo, do vậy việc pha loãng thuốc tẩy 10-100 lần từ nồng độ gốc sẽ cho hiệu quả tốt.

Tôi thường có xu hướng sử dụng Clorox pha loãng 10 lần, còn trong nghiên cứu được đề cập ở trên, Prince và Andrus sử dụng nồng độ pha loãng khoảng 20 lần. Tùy vào mục đích sử dụng mà bạn có thể lựa chọn nồng độ pha loãng phù hợp cho mình.

Cách thức và thời gian khử nhiễm

– Cách thức: Phun/ xịt khu vực làm PCR/ thiết bị với 10% thuốc tẩy, sau đó để yên trong 15-30 phút. Tiếp theo lau sạch thuốc tẩy bằng nước sạch – vì thuốc tẩy có tính ăn mòn mạnh, nên nó sẽ phá hủy vật liệu nếu không được loại bỏ kỹ với nước sạch.

– Thời gian: Quy trình lau rửa này nên được thực hiện trước và sau mỗi lần làm PCR. Bạn có thể lên lịch vệ sinh các thiết bị và khu vực làm PCR hàng tuần, đây cũng là một cách rất hữu hiệu để ngăn chặn việc nhiễm trong phản ứng PCR.

Những điểm quan trọng về việc pha loãng và bảo quản thuốc tẩy:

1. Dùng nước sạch để pha loãng thuốc tẩy

Tôi thường sử dụng nước máy và đến nay nó vẫn hoat động rất hiệu quả nhưng hypochlorites thường không ổn định và phân hủy nhanh chóng trong nước cứng, do đó làm giảm lượng phân tử clo. Vì vậy, để đảm bảo hơn, bạn nên sử dụng nước tinh khiết.

2. Nên pha loãng thuốc tẩy thường xuyên

Hiệu quả của thuốc tẩy sẽ giảm theo thời gian, vì vậy, việc pha loãng thuốc tẩy fresh (tươi) là điều rất cần thiết. Nếu bạn không ngửi thấy mùi clo trong thuốc tẩy, thì đã đến lúc cần pha loãng lại chúng. Tôi thường bảo quản dung dịch thuốc tẩy pha loãng (1:10) trong khoảng 1-2 tuần.

3. Pha loãng ở nhiệt độ phòng trong dụng cụ đục màu (tránh ánh sáng)

Chúng tôi sử dụng thường sử dụng chai nhựa dạng xịt để chứa dung dịch thuốc tẩy pha loãng và bảo quản chúng dưới bồn rửa. Nhiệt độ, ánh sáng và oxy sẽ góp phần làm phân hủy thuốc tẩy.

4. Hãy chắc chắn rằng bạn sử dụng đúng loại PPE khi thao tác với thuốc tẩy

Khi thao tác với thuốc tẩy, cần đảm bảo các nguyên tắc an toàn như: mặc áo blouse, đeo găng tay, kính an toàn, khẩu trang…

(Nguồn: sinhhocvietnam)