KỸ THUẬT TÁCH CHIẾT NUCLEIC ACID

MỤC LỤC BÀI VIẾT

1. Tổng quan về các kỹ thuật tách chiết nucleic acid
2. Kỹ thuật tách chiết nucleic hóa học
3. Kỹ thuật tách chiết nucleic acid pha rắn
4. Kỹ thuật tách chiết thủ công và tự động

1. Tổng quan về các kỹ thuật tách chiết nucleic acid

Trong lĩnh vực Sinh học phân tử và Di truyền học, tách chiết nucleic acid từ mẫu sinh học là một bước cơ bản và quan trọng. Bước tách chiết nucleic acid không chỉ đơn giản là phân lập DNA hay RNA từ mẫu mà còn là bước chuẩn bị ban đầu cho nhiều phân tích khác nhau tiếp theo sau đó. Về cơ bản, quá trình này bao gồm 4 bước chính:

(1) Ly giải tế bào

(2) Loại bỏ protein, lipid và các tạp chất khác trong dung dịch

(3) Tinh sạch nucleic acid (DNA hay RNA)

(4) Hòa nucleic acid vào dung dịch đệm hoặc nước để bảo quản (El-Ashram và cộng sự, 2016)

Các kỹ thuật tách chiết nucleic acid phổ biến hiện nay được chia thành 2 nhóm loại chính, phụ thuộc vào bản chất vật liệu sử dụng, bao gồm:

Dùng tách chiết dùng chất hóa học

Tách chiết pha rắn (solid-phase) (Chacon-Cortes và Griffiths, 2014).

Về cách thức thực hiện, trước đây bước tách chiết nucleic acid đều được thực hiện thủ công do vậy chất lượng kết quả phụ thuộc khá nhiều vào thao tác người làm, hiện nay các hệ thống tách chiết tự động hóa đang dần phát triển nhằm giảm bớt áp lực về tay nghề của kỹ thuật viên cũng như đáp ứng yêu cầu tách chiết với số lượng mẫu lớn. Theo đó, mỗi kỹ thuật đều sẽ có ưu điểm cũng như hạn chế riêng và việc chọn lựa phải phù hợp với điều kiện thí nghiệm cũng như các yêu cầu cụ thể khi thực hiện.

2. Kỹ thuật tách chiết nucleic hóa học

Kỹ thuật tách chiết nucleic acid hóa học đã từ lâu đã được sử dụng phổ biến trong các nghiên cứu hay xét nghiệm sinh học phân tử, theo đó DNA/RNA sẽ được tủa bằng hóa chất và dùng lực ly tâm để phân tách chúng ra khỏi các thành phần tạp chất khác trong dung dịch. Bảng 1 tóm tắt các thông tin cơ bản về kỹ thuật tách chiết nucleic acid hóa học.

Bảng 1: Kỹ thuật tách chiết nucleic acid hóa học

STT	Kỹ thuật	Nguyên lý	Ưu điểm	Nhược điểm
1	Phenol-chloroform	Dựa trên sự khác biệt trong tính hòa tan của các thành phần trong mẫu khi tiếp xúc với phenol và chloroform	Độ tinh sạch và hiệu suất tách chiết cao	Sử dụng hóa chất độc hạiYêu cầu thao tác tay cao
2	CTAB	Sự tạo ra phức chất ổn định giữa CTAB và DNA, sau đó loại bỏ các polysaccharide và các tạp chất khác không mong muốn khỏi mẫu.	Tách chiết hiệu quả đối với các mẫu giàu polysaccharide như mẫu thực vật.	Thời gian tách chiết dài Sử dụng hóa chất độc hại
3	Chelex	Sử dụng hạt nhựa chứa chất chelating Chelex để hấp phụ các ion kim loại có trong mẫu, giúp loại bỏ các tạp chất và thu hồi nucleic acid	Đơn giản, nhanh chóng Không yêu cầu thiết bị chuyên biệt	Không dùng cho lượng mẫu lớnKhông phù hợp để tách chiết mẫu chứa nhiều polysaccharideKhông có khả năng loại bỏ hiệu quả các chất ức chế PCR
4	Alkaline	Sử dụng dung dịch kiềm có pH cao (pH 11 -12 như SDS – NaOH) để phá vỡ cấu trúc tế bào. Việc bổ sung kali acetate (pH 5,2) sẽ trung hòa hỗn hợp và dẫn đến sự tái tạo plasmidcũng như DNA bộ gen. DNA plasmid được thu nhận nhờ tủa bằng ethanol/ isopropanol và lực ly tâm.	Đơn giản và nhanh chóngThu hồi lượng lớn DNA plasmid	Dung dịch kiềm có thể phân hủy nucleic acid nếu không được trung hòa kỹ càngĐộ tinh sạch thấp

(Chacon-Cortes và Griffiths, 2014)

3. Kỹ thuật tách chiết nucleic acid pha rắn

Bên cạnh việc sử dụng chất hóa học, các vật liệu rắn cũng đã được sử dụng phổ biến trong tách chiết nucleic acid. Bảng 2 tóm tắt các thông tin cơ bản về kỹ thuật tách chiết nucleic acid pha rắn.

Bảng 2: Kỹ thuật tách chiết nucleic acid pha rắn

STT	Kỹ thuật	Nguyên lý	Ưu điểm	Nhược điểm
1	Hạt silica	Bề mặt silica được bao phủ bởi các ion dương, giúp tăng cường khả năng liên kết của DNA tích điện âm.	– Hiệu suất thu hồi cao tạo các tương tác có chọn lọc với nucleic acid. – Áp dụng cho nhiều loại mẫu sinh học khác nhau, từ mẫu máu, mẫu tế bào đến mẫu mô và mẫu vi sinh vật.	– Không hiệu quả cao với đoạn DNA kích thước lớn vì có thể liên kết chặt chẽ với màng silica. – Cần máy ly tâm khi sử dụng.
2	Hạt từ	– Hạt từ được hoạt hóa với các phân tử hoặc ligand có khả năng tương tác chọn lọc với nucleic acid trong mẫu. – Sau đó hạt từ được thu hồi bằng cách sử dụng một lực hút nam châm nhằm loại bỏ các tạp chất và thu hồi nucleic acid.	– Hiệu suất thu hồi cao – Tạo các tương tác có chọn lọc với nucleic acid. – Áp dụng cho nhiều loại mẫu sinh học khác nhau, từ mẫu máu, mẫu tế bào đến mẫu mô và mẫu vi sinh vật.	– Chi phí cao. – Cần máy ly tâm khi sử dụng.
3	Hạt thủy tinh	Hạt thủy tinh có bề mặt được chứa các nhóm silanol (-SiOH), để tương tác với và thu hồi nucleic acid từ mẫu.	– Hiệu suất thu hồi caoTạo các tương tác có chọn lọc với nucleic acid. – Áp dụng cho nhiều loại mẫu sinh học khác nhau, từ mẫu máu, mẫu tế bào đến mẫu mô và mẫu vi sinh vật	– Chi phí cao – Cần thiết bị chuyên dụng
4	Vật liệu trao đổi anion	Sử dụng diethylaminoethyl cellulose (DEAE) tích điện dương tạo liên kết với gốc triphosphatetích điện âm của nucleic acid.	– Độ tinh sạch cao – Có thể tái sử dụng	Nồng độ muối cao trong bước rửa giải, do đó cần khử muối để tránh ảnh hướng đến hiệu quả các bước thí nghiệm tiếp theo

4. Kỹ thuật tách chiết thủ công và tự động

Hầu hết các kỹ thuật hóa học hay pha rắn trước đây đều được thực hiện thủ công cả quá trình. Theo đó, các bước tách chiết đều được thực hiện bằng tay, từ việc chuẩn bị các dung dịch và hỗn hợp tách chiết đến việc ly giải mẫu, rửa và thu nhận nucleic acid. Do vậy, kỹ thuật thủ công đòi hỏi sự cẩn thận và kiểm soát chất lượng ở từng bước để đảm bảo độ chính xác và độ tin cậy của kết quả cuối cùng.

Hiện nay, cột quay (spin column) được dùng để hỗ trợ cho quá trình tách chiết thủ công, trong đó hạt silica được dùng nhiều trong cột quay để làm lớp màng gắn với các nucleic acid (Hình 1).

Về nguyên tắc, các phân tử nucleic acid gắn vào bề mặt của hạt silica khi trong dung dịch có mặt muối chaotropic và ethanol nhờ vào các cầu nối cation được hình thành. Sau khi nucleic acid gắn lên bề mặt silica thì các tạp chất khác sẽ được loại bỏ qua màng nhờ vào lực ly tâm. Nucleic acid sau đó được rửa giải ra khỏi cột silica bằng cách sử dụng một dung dịch đệm có pH phù hợp (pH từ 8-9 đối với DNA, pH 4-5 đối với RNA).

Hiện nay, kỹ thuật này được tối ưu hóa về mặt thời gian cũng như độ chính xác cao thì các hóa chất dùng đã được gói gọn trong các bộ sản phẩm có sẵn (kit). Kit tách chiết cột silica được sử dụng phổ biến cho tính tiện dụng, hóa chất tinh khiết và có thể tách chiết lên tới 96 mẫu/bộ kit. Một quá trình tách chiết cột silica bằng hóa chất trong bộ kit cũng bao gồm các bước ly giải, gắn nucleic acid, rửa tạp chất và thu nhận nucleic acid tinh sạch (Hình 2).

Như vậy, nhờ vào cải tiến so với các kỹ thuật tách chiết thủ công trước đây, cột silica cho hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch cao, quy trình đơn giản, thời gian nhanh chóng. Tuy vậy, kỹ thuật này vẫn đòi hỏi kỹ thuật cao từ người thao tác, cần máy ly tâm hỗ trợ và gặp hạn chế khi xử lý số lượng mẫu lớn. Do vậy, hiện nay công đoạn tách chiết nucleic acid đang dần được tự động hóa để khắc phục những hạn chế này.

tách chiết cột silica — **Hình 1.** Cột quay gắn silica

quy trình tách chiết cột silica — **Hình 2.** Quy trình tách chiết nucleic acid bằng cột silica theo bộ kit ABT

Kỹ thuật tách tự động hiện nay sử dụng hạt từ phủ silica để làm vật liệu gắn với nucleic acid. Điều này giống với tách hạt từ thủ công, điểm khác biệt chính đó là hạt từ “chủ động” di chuyển có định hướng nhờ vào sự điều khiển có kiểm soát lực từ trường bên ngoài.

Với hệ thống tách từ tự động giúp loại bỏ máy ly tâm ra khỏi các bước trong quá trình tách chiết. Bên cạnh đó công suất tách chiết của các máy tách chiết hiện nay lên đến 96 mẫu cho một lần tách chiết.

Điều này giải quyết vấn đề về số lượng mẫu lớn, tiết kiệm thời gian hơn so với tách chiết thủ công. Và nhờ vào sự tự động hóa đã làm giảm áp lực về mặt nhân lực tay nghề cao, do việc điều chỉnh quy trình tự động đơn giản và dễ hiểu.

Như vậy, các hệ thống tách từ tự động ngày càng dần trở nên phổ biến do khả năng tăng năng suất, độ chính xác và độ tin cậy cao, cùng với tính linh hoạt và điều chỉnh dễ dàng. Điều này giúp tối ưu hóa quy trình tách chiết nucleic acid và giảm thiểu thời gian và nguồn lực cần thiết cho các nghiên cứu và ứng dụng sinh học phân tử.

Hình 3 và Hình 4 lần lượt mô tả về hệ thống tách chiết EZ32 (ABT) với quy trình tự động hóa nhanh chóng và công suất 32 mẫu/lần thực hiện trong thời gian khoảng 30 phút. Và đây cũng là dòng máy tách chiết tự động đầu tiên được sản xuất ngay tại Việt Nam với những tính năng vượt trội đáp ứng được các nhu cầu đạt hiệu quả cao trong quá trình tách chiết.

máy tách chiết ez32 — **Hình 3.** Máy tách chiết EZ32 (hãng ABT)

**Hình 4.** Quy trình tách chiết từ tự động của máy EZ32

Bảng 3: Kỹ thuật tách chiết cột silica và tách từ tự động

Kỹ thuật	Cột silica	Từ tự động
Ưu điểm	– Loại được chất ức chế có trong mẫu – Hiệu suất thu hồi cao – Độ tinh sạch cao – DNA/RNA thu nhận có thể bảo quản trong thời gian dài – Thời gian thực hiện tương đối nhanh (35phút/10 mẫu)	– Loại được chất ức chế có trong mẫu – Hiệu suất thu hồi cao – Độ tinh sạch cao – DNA/RNA thu nhận có thể bảo quản trong thời gian dài – Thời gian thực hiện nhanh (32-96 mẫu/25 phút) – Được tự động hóa, dễ thực hiện – Ít khả năng lây nhiễm chéo – Quy trình dễ thực hiện và đơn giản, không đòi hỏi kỹ thuật cao
Nhược điểm	– Phải sử dụng các thiết bị hỗ trợ (ly tâm, bể ủ nhiệt, vortex) – Lương DNA thu được bị giới hạn bởi diện tích màng – Đòi hỏi kỹ thuật viên tay nghề cao	Chi phí cao (do phải cần hệ thống tách tự động)

Như vậy, theo nhu cầu sử dụng, sự phát triển liên tục của công nghệ cũng đã cải thiện và tối ưu hóa bước tách chiết nucleic acid. Dù vậy, với mỗi phương pháp, điều quan trọng là hiểu rõ nguyên lý hoạt động, ưu điểm và hạn chế, cũng như đánh giá khả năng áp dụng trong các điều kiện thực tế cụ thể. Việc lựa chọn kỹ thuật tách chiết nucleic acid phù hợp không chỉ ảnh hưởng đến chất lượng của mẫu thu được mà còn quyết định đến kết quả cuối cùng của quá trình nghiên cứu hay xét nghiệm.

Tài liệu tham khảo

1. Ali, N., Rampazzo, R. D. C. P., Costa, A. D. T., & Krieger, M. A. (2017). Current nucleic acid extraction methods and their implications to point-of-care diagnostics. BioMed research international, 2017.

2. Chacon-Cortes, D., & Griffiths, L. R. (2014). Methods for extracting genomic DNA from whole blood samples: current perspectives. Journal of Biorepository Science for Applied Medicine, 1-9.

3. Sahu, S. K., AS, O. P. L., Sarawat, S., & Yadav, N. (2021). A comparative study of silica spin column based and magnetic bead based RNA extraction and purification kits on COVID-19 samples. Int J Med Res Prof, 7(1), 56-62.