Các phương pháp tiếp cận mới để thu thập mẫu trong quá trình giám sát thú y là cần thiết và hợp lý. Tuy nhiên, nếu không biết bản chất của một mầm bệnh cụ thể, các phương pháp lấy mẫu thay thế có thể không hiệu quả để chẩn đoán bệnh đúng cách, điều này có thể dẫn đến hậu quả nghiêm trọng cho cả động vật và con người. Dưới đây là những lưu ý về các loại mẫu ASFV.

MỤC LỤC BÀI VIẾT

1. Bệnh dịch tả heo châu Phi (African Swine Fever – ASF)
2. Các loại mẫu xét nghiệm ASF cho phương pháp Real-time PCR
3. Tải lượng ASFV trong các loại mẫu xét nghiệm
3. Kết luận
4. Tài liệu tham khảo

1. Bệnh dịch tả heo châu Phi (African Swine Fever – ASF)

Bệnh dịch tả heo châu Phi là một bệnh truyền nhiễm nguy hiểm, có đặc điểm lây lan nhanh và xảy ra ở mọi loài lợn (cả lợn nhà và lợn hoang dã). Bệnh gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng cho người chăn nuôi với tỷ lệ chết cao lên đến 100%. Bệnh Dịch tả heo châu Phi do một vi rút cùng tên gây ra (African Swine Fever Virus – ASFV).

ASFV là một virus DNA sợi kép, lớn, sao chép trong tế bào chất của tế bào bị nhiễm. ASFV xâm nhập và sao chép trong các tế bào thuộc hệ thống thực bào đơn nhân (mononuclear phagocyte system), chủ yếu là các bạch cầu đơn nhân (monocytes) và các đại thực bào (macrophages) [1]. Sau đó, ASFV di chuyển theo đường máu để có thể lây nhiễm và phát độc lực đến các cơ quan khác trong cơ thể heo nhiễm bệnh. Hiện nay, để phòng ngừa mầm bệnh xâm nhập và lây nhiễm, việc phát hiện sớm là rất quan trọng. Theo khuyến cáo của tổ chức Thú y thế giới (OIE), Real-time PCR được sử dụng như một phương pháp tiêu chuẩn để chẩn đoán ASFV.

2. Các loại mẫu xét nghiệm ASF cho phương pháp Real-time PCR

Việc lấy mẫu phải tuân thủ đúng quy trình kỹ thuật, đảm bảo an toàn sinh học để ngăn ngừa ô nhiễm, phát tán mầm bệnh ra môi trường; đồng thời ngăn ngừa sự phơi nhiễm của động vật, con người với các tác nhân gây bệnh. Lấy mẫu bệnh phẩm phải đảm bảo phù hợp với từng loại bệnh và phương pháp xét nghiệm, mang tính đại diện. Trước khi lấy mẫu, phải xem xét loại mẫu cần lấy, dung lượng mẫu, số lượng mẫu phải đảm bảo đủ cho các xét nghiệm và việc lưu mẫu.

Theo khuyến nghị của Tổ chức Thú y Thế giới (OIE), khi nghi nhờ heo bị nhiễm AFSV các mẫu sau đây phải được gửi đến phòng thí nhiệm để làm xét nghiệm: máu được bảo chống đông (EDTA cho PCR, heparin hoặc EDTA cho phân lập virus), huyết thanh và mô (chủ yếu là lá lách, hạch bạch huyết, tủy xương, phổi, amidan và thận) [2]. Ngoài ra, đối với những phương pháp có độ nhạy cao như Realtime PCR còn có thể sử dụng những mẫu không xâm lấn: mẫu dịch phết bề mặt dụng cụ, môi trường, dịch phết mũi (Nasal swab), dịch phết miệng (Oral swab), dịch phết trực tràng (Rectal swab) và cả mẫu phân (vì virus có khả năng tồn tại trong phân 11 ngày ở nhiệt độ phòng) [3]

3. Tải lượng ASFV trong các loại mẫu xét nghiệm

Các loại mẫu bệnh phẩm được khuyến nghị sử dụng bởi Tổ chức Thú y Thế giới đều giúp phát hiện ASFV trong heo nhiễm bệnh (Hình 1). Trong đó, mẫu máu được bảo quản bởi EDTA và mẫu lá lách là hai nhóm mẫu được xác định là có tải lượng virus cao hơn hẳn so với những nhóm mẫu còn lại [4].

Tuy nhiên, việc sử dụng các loại mẫu mô lại không phù hợp cho những xét nghiệm với mục đích tầm soát ASFV. Những hạn chế về thời gian lấy mẫu và chi phí mỗi lần lấy mẫu sẽ trở thành những trở ngại lớn cho việc lấy mẫu thường xuyên. Mặt khác, lấy mẫu máu là một phương pháp cơ bản được sử dụng trong giám sát thú y nhưng nó có thể gây hại cho động vật. Trong quá trình lấy mẫu máu để xét nghiệm tầm ASFV, heo có thể bị căng thẳng (stress) và đau đớn. Đồng thời cũng tiềm ẩn nhiều nguy hiểm khác cho người thực hiện trong quá trình lấy máu.

Hiện nay, lấy mẫu không xâm lấn cho xét nghiệm tầm soát đang là giải pháp hiểu quả giúp giải quyết những khó khăn trên. Mẫu dịch phết bề mặt dụng cụ, môi trường, dịch phết mũi, dịch phết miệng, dịch phết trực tràng,… có thể được thu thập dễ dàng và thường xuyên. Giải pháp thay thế này đang là phương pháp tiếp cận mới để thu thập mẫu trong quá trình giám sát thú y. Tuy nhiên, nghiên cứu của Walczak và cộng sự [5], tải lượng virus giữa mẫu máu, mẫu dịch phết mũi và mẫu dịch phết miệng có sự khác biệt đáng kể ở heo bị nhiễm các chủng độc lực cao (Hình 2).

**Hình 2:** Đồ thị biểu diễn ma trận thống kê kết quả qPCR [5].
*(A) Phân tích thống kê các giá trị Ct trung bình trong các nhóm mẫu khác nhau: Blood – mẫu máu, Oral – mẫu dịch phết miệng, Rectal – mẫu dịch phết trực tràng.*
*(B) Phân tích thống kê giá trị Ct trung bình được ghi nhận trong máu giữa các chủng độc lực (T1 và T2) và chủng giảm động lực (T3).*

Dù mẫu máu, mẫu dịch phết mũi và mẫu dịch phết miệng được thu thập trong cũng một khoảng thời gian, nhưng khả năng phát hiện ASFV trên heo trong các loại mẫu là khác nhau vì những yếu tố sau:

Đặc điểm của virus: chẳng hạn như vật chủ và các tế bào mục tiêu. ASFV nhắm vào các bạch cầu đơn nhân và các đại thực bào tồn tại chủ yếu trong máu hoặc bạch huyết. Do đó, điều tự nhiên là sự hiện diện của virus trong các loại mẫu như nước bọt, phân hoặc nước tiểu, có thể thấp hơn (giá trị Ct cao hơn) so với trong mẫu máu.
Nền mẫu: xét nghiệm real-time PCR mặc dù là tiêu chuẩn vàng trong phát hiện ASFV; tuy nhiên, phản ứng Real-time PCR cũng có thể bị ức chế bởi các nền mẫu khác nhau.

Để giảm thiểu tác nhân gây ức chế cho phản ứng Real-time PCR, cần chọn loại hóa chất tách chiết dùng được cho đa dạng mẫu đầu vào và hiệu suất cao. Tiêu biểu trên thị trường hiện nay là TOPPURE® VIRAL DNA/RNA EXTRACTION KIT dành cho tách cột (tách tay) và TOPPURE® MAGA GENOMIC DNA/RNA EXTRACTION KIT dành cho tách máy đến từ thương hiệu ABT.

3. Kết luận

Mặc dù lấy mẫu không xâm lấn giúp tiết kiệm thời gian và chi phí, nhưng phải luôn đảm bảo việc hiểu rõ về bệnh cần chuẩn đoán để đảm bảo được kết quả chính xác nhất. Sự hiện diện của vật liệu di truyền của ASFV được phát hiện trong mẫu máu là lớn hơn đáng kể so với các loại mẫu khác. Việc lấy mẫu máu dường như là đáng tin cậy nhất để chẩn đoán ASFV và phù hợp với các khuyến nghị của Tổ chức Thú y Thế giới.

Tuy nhiên, việc kết hợp lấy mẫu không xâm lấn và mẫu máu có thể là giải pháp tối ưu nhất cho xét nghiệm tầm soát ASFV. Giải pháp này giúp giải quyết vấn đề tải lượng virus thấp trong các mẫu không xâm lấn, đồng thời giúp kéo dài thời gian giữa những lần lấy mẫu máu nhằm làm giảm chi phí cho người chăn nuôi và sự nguy hiểm tiềm ẩn cho vật nuôi.

Cuối cùng cũng là quan trọng nhất, việc lựa chọn hóa chất xét nghiệm đóng vai trò then chốt ảnh hưởng đến kết quả mục tiêu của xét nghiệm tầm soát ASFV. Để cho ra kết quả tốt nhất, hóa chất dùng trong phương pháp Real-time PCR cần được thiết kế cho việc phát hiện nhanh và chính xác sự hiện diện của virus gây bệnh dịch tả lợn Châu Phi trên nhiều nền mẫu khác nhau, đồng thời có độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Nổi bật trên thị trường có thể kể đến bộ TOPSPEC® ASFV QPCR KIT đến từ thương hiệu ABT. Ngoài các ưu điểm trên, bộ TOPSPEC® ASFV QPCR KIT còn là lựa chọn kinh tế khi quy trình được tối ưu hóa đơn giản, cung cấp mastermix thêm để chạy đối chứng (75 test), tương thích với hầu hết các máy Realtime PCR trên thị trường: Rotor Gene Q (Qiagen), 7500, 7500 Fast (Thermo Fisher), AriaMX, Mx 3005p, Bioer, Dlab,…

4. Tài liệu tham khảo

Chapter Three – African Swine Fever Virus Biology and Vaccine Approaches.
World Organisation for Animal Health . Chapter 3.8.1 African Swine Fever (Infection with African Swine Fever Virus) World Organisation for Animal Health; Paris, France: 2019.
European Commission . Commission Decision of 26 May 2003 Approving an African Swine Fever Diagnostic Manual (2003/422/ec) Volume L143. European Commission; Brussels, Belgium: 2003. pp. 35–49.
Lee, H.S., Bui, V.N., Dao, D.T. et al. Porc Health Manag 7, 36 (2021).
Pikalo J, Deutschmann P, Fischer M, Roszyk H, Beer M, Blome S. African Swine Fever Laboratory Diagnosis-Lessons Learned from Recent Animal Trials. Pathogens. 2021 Feb 6;10(2):177. doi: 10.3390/pathogens10020177. PMID: 33562103; PMCID: PMC7915929.
Walczak M, Szczotka-Bochniarz A, Żmudzki J, Juszkiewicz M, Szymankiewicz K, Niemczuk K, Pérez-Núñez D, Liu L, Revilla Y. Non-Invasive Sampling in the Aspect of African Swine Fever Detection-A Risk to Accurate Diagnosis. Viruses. 2022 Aug 11;14(8):1756. doi: 10.3390/v14081756. PMID: 36016380; PMCID: PMC9416727.