Bệnh đốm trắng trên tôm, các phương pháp xét nghiệm

Virus hội chứng đốm trắng là gì

Virus hội chứng đốm trắng (WSSV) là một virus lây nhiễm cao là nguyên nhân gây tử vong hàng loạt trên tôm sú nuôi như tôm sú (P. monodon) và tôm thẻ chân trắng (P. vannamei) trên toàn thế giới. Tôm nhiễm thường được xác định bởi các đốm trắng trên vỏ của nó. Tỷ lệ tử vong cao là xảy ra từ 80% đến 100% chỉ vài ngày sau khi nhiễm. Phát hiện WSSV ở tôm là rất quan trọng cho việc quản lý các trang trại nuôi tôm. Như một biện pháp để giảm thiểu thiệt hại kinh tế nghiêm trọng do sự bùng nổ của bệnh đốm trắng gây ra.

Biểu hiện

• Bệnh đốm trắng ở tôm do virus gây ra (White Spot Syndrome Virus – WSSV): tôm có biểu hiện hoạt động kém. Ăn nhiều đột ngột sau đó bỏ ăn. Bơi lờ đờ ở mặt nước hay dạt vào bờ. Quan sát vỏ tôm có nhiều đốm trắng ở giáp đầu ngực, đốt bụng thứ 5, 6 và lan toàn thân. Đôi khi tôm cũng có dấu hiệu đỏ thân. Khi các đốm trắng xuất hiện, sau 3 – 10 ngày tôm chết hàng loạt với tỉ lệ chết cao và nhanh.

• Bệnh do vi khuẩn gây ra (Bacteria White Spot Syndrome – BWSS): khi mới nhiễm khuẩn tôm vẫn ăn mồi, lột xác và chưa thấy các đốm trắng trên tôm. Tuy nhiên, quá trình lột xác bị chậm lại, tôm chậm lớn. Khi bệnh nặng, tôm không chết hàng loạt mà sẽ chết rải rác, hầu hết tôm bị đóng rong, mang bị bẩn. Lúc này quan sát tôm mới thấy các đốm trắng mờ đục hình tròn nhỏ trên vỏ khắp cơ thể.

Các phương pháp chẩn đoán bệnh đốm trắng:

• Xét nghiệm sinh học phân tử
• Dưa vào dấu hiệu bệnh lý

Chẩn đoán dựa vào xét nghiệm sinh học phân tử:

1. Phương pháp Nested PCR

B1: Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm:

–  Đối với tôm giống, ấu trùng và hậu ấu trùng: Sử dụng nguyên con;

–  Đối với tôm bố mẹ, tôm thương phẩm: Lấy mang, chân bơi, đuôi, giáp đầu ngực, máu, cơ bụng.

–  Mẫu được nghiền nhuyễn với tỷ lệ 1 thể tích mẫu trong 9 thể tích dung dịch muối đệm PBS

B2: Tách chiết:

• Sử dụng các bộ kit thích hợp, và theo hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất.

VD: TopPURE ® HIGHPURE VIRAL EXTRACTION KIT có thể tách DNA và RNA bằng phương pháp tách cột.

Hoặc: TopPURE ® CRUDE DNA EXTRACTION KIT sử dụng phương pháp tách thô

B3: Tiến hành phản ứng Nested PCR:
Phản ứng khuếch đại được thực hiện trong máy nhân gen theo phương pháp nested PCR bao gồm 2 giai đoạn (hoặc 2 bước): Giai đoạn 1 (bước 1), thực hiện phản ứng PCR sử dụng cặp mồi 146F1/146R1; Giai đoạn 2 (bước 2), thực hiện phản ứng nested PCR sử dụng cặp mồi 146F2/146R2.

B4: Điện di:

Pha thạch với nồng độ agarose từ 1,5 % đến 2 % bằng dung dịch đệm TBE 1X hoặc TAE 1X.

Tiến hành đổ thạch vào khay điện di đã được cài lược; không nên đổ bản thạch dày quá 0,8 cm.

Khi bản thạch đông lại thì tiến hành gỡ lược khỏi bản thạch.

Chuyển bản gel vào bể điện di, đổ dung dịch đệm (TBE 1X hoặc TAE 1X) cùng loại với dung dịch pha thạch agarose đã đun vào bể điện di cho tới khi ngập bản thạch.

Nhỏ mẫu điện di.

B5: Đọc kết quả:

Sau khi điện di, đọc kết quả trên máy đọc gel (4.1.7).

Điều kiện phản ứng được công nhận khi:

– Mẫu đối chứng âm không có vạch sáng (không có sản phẩm khuếch đại);

– Mẫu đối chứng dương có vạch sáng kích thước 941 bp.

Với điều kiện phản ứng trên:

Kết quả mẫu thử dương tính khi:

– Tại giếng mẫu thử xuất hiện vạch sáng có kích thước 941 bp.

– Thang chuẩn ADN phân vạch rõ ràng.

Kết quả mẫu thử âm tính khi:

– Tại giếng mẫu thử không xuất hiện vạch sáng.

– Thang chuẩn ADN phân vạch rõ ràng

2. Phương pháp real time PCR

B1: Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm:

–  Đối với tôm giống, ấu trùng và hậu ấu trùng: Sử dụng nguyên con;

–  Đối với tôm bố mẹ, tôm thương phẩm: Lấy mang, chân bơi, đuôi, giáp đầu ngực, máu, cơ bụng.

–  Mẫu được nghiền nhuyễn với tỷ lệ 1 thể tích mẫu trong 9 thể tích dung dịch muối đệm PBS

B2: Tách chiết:

• Sử dụng các bộ kit thích hợp, và theo hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất.

VD: TopPURE ® HIGHPURE VIRAL EXTRACTION KIT có thể tách DNA và RNA bằng phương pháp tách cột.

Hoặc: TopPURE ® CRUDE DNA EXTRACTION KIT sử dụng phương pháp tách thô

B3: Tiến hành phản ứng realtime PCR

     Phản ứng khuếch đại được thực hiện trong máy Realtime PCR theo phương pháp Realtime PCR khuếch đại đoạn gen đặc hiệu của vi rút WSSV sử dụng cặp mồi đặc hiệu WSSV1011F /WSSV1079R và đoạn dò WSSV-p.

Theo: TCVN 8710-3:2019: BỆNH THỦY SẢN – QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN – PHẦN 3: BỆNH ĐỐM TRẮNG Ở TÔM

B4: Đọc kết quả

Điều kiện của phản ứng được công nhận khi:

– Mẫu đối chứng âm phải cho kết quả âm tính (không có giá trị Ct).

– Mẫu đối chứng dương phải cho kết quả dương tính và có giá trị Ct so với giá trị Ct của mẫu đã được chuẩn độ trước đó có khoảng giá trị Ct = ± 2

Với điều kiện phản ứng như trên:

– Mẫu có giá trị Ct < 35 được xem là dương tính

– Mẫu không có giá trị Ct là âm tính

– Mẫu có giá trị Ct trong khoảng 35 ≤ Ct ≤ 40 được xem là nghi ngờ.

CHÚ Ý: – Những mẫu nghi ngờ, cần được thực hiện xét nghiệm lại hoặc sử dụng phương pháp xét nghiệm tương đương khác để khẳng định kết quả.

– Phản ứng realtime PCR phải bao gồm: mẫu kiểm tra, mẫu kiểm chứng dương và mẫu kiểm chứng âm;

– Mẫu và nguyên liệu cho phản ứng realtime PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng.

Giải pháp ABT cung cấp