Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật
MỤC LỤC BÀI VIẾT
1. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào
Tế bào động vật tách ra từ mô, có thể được nuôi cấy trên các loại môi trường dinh dưỡng tổng hợp bên ngoài cơ thể, và chúng sinh trưởng bằng cách tăng số lượng và kích thước tế bào. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào đã mở ra cơ hội để nghiên cứu các tế bào ung thư, phân loại các khối u, xác định sự tương hợp của mô cấy ghép, sự tương tác giữa các tế bào….Đặc biệt, kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật có vú được ứng dụng nhiều trong sản xuất các hợp chất hóa sinh quan trọng, dùng trong chẩn đoán và điều trị như các hooc môn sinh trưởng, interferon , các kháng thể, đặc biệt là các vắc xin phòng bệnh.
2. Các yêu cầu cơ bản của nuôi cấy tế bào
Có bốn yêu cầu cơ bản để nuôi cấy tế bào thành công. Đầu tiên là nhà xưởng, trang thiết bị.. Các trang thiết bị tối thiểu cần phải có: Tủ an toàn sinh học, máy ly tâm chuyên sử dụng cho nuôi cấy tế bào, tủ ấm CO2, bể ổn nhiệt, kính hiển vi. Đối với các tế bào linh trưởng, tế bào ung thư, tế bào bị nhiễm Mycoplasma cần nuôi cấy trong tủ an toàn sinh học cấp độ 2 trở lên. Hệ thống nuôi cấy cần đạt tiêu chuẩn bảo vệ cả người làm việc và tế bào không bị lây nhiễm, được thiết kế theo các yêu cầu an toàn phòng thí nghiệm (ISO, GMP).
Tiếp đến là yêu cầu về vô trùng. Tủ an toàn sinh học cần phải được hoạt động trước khi bắt đầu làm việc ít nhất 15 phút để làm sạch không khí có thể bị nhiễm từ trước đó. Khu vực làm việc bên trong tủ cấy phải được khử trùng ( thường sử dụng cồn 70o hoặc isopropanol). Các nguyên vật liệu cũng cần được khử trùng trước khi đưa vào khu vực làm việc (hấp sấy tiệt trùng, lau cồn hoặc bật đèn tím). Người làm việc phải mặc trang phục bảo hộ đầy đủ.
Thứ ba là nguồn nguyên vật liệu phải đạt tiêu chuẩn. Các tế bào rất nhạy cảm đối với điều kiện dinh dưỡng, pH, điều kiện nuôi cấy… Do đó, cần chọn nguồn nguyên vật liệu phù hợp. Các vật liệu dùng trong nuôi cấy nên được kiểm tra xác nhận chất lượng và đảm bảo không bị nhiễm khuẩn, đặc biệt đối với huyết thanh. Vì vậy, nên sử dụng các sản phẩm của những nhà cung cấp có uy tín.
Cuối cùng, yếu tố con người đóng vai trò quyết định. Người thực hiện nuôi cấy tế bào phải có kiến thức và kinh nghiệm thực hành tốt. Đồng thời chấp hành các quy trình chuẩn đã được thẩm định đảm bảo cho sự thành công của việc nuôi cấy tế bào.
3. Sự sinh trưởng của tế bào động vật trong nuôi cấy
Sự sinh trưởng của tế bào động vật invitro thường trải qua 4 giai đoạn:
– Pha chậm (Lag phase) là giai đoạn khi tế bào được đưa vào môi trường nuôi cấy cho đến khi tế bào bắt đầu phát triển. Thời gian này dài hay ngắn tùy thuộc vào trạng thái biệt hóa của mô được lấy tế bào.
– Pha logarit (Log Phase) hay Pha tiến triển (exponential phase) là giai đoạn tế bào phân chia liên tục, tăng nhanh số lượng tế bào. Trong giai đoạn này, tế bào sinh trưởng và phân cắt với nhịp độ tối đa so với bản tính di truyền của chúng nếu gặp môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp. Nhịp độ sinh trưởng của chúng là không thay đổi trong suốt giai đoạn này, các tế bào phân đôi một cách đều đặn. Quần thể tế bào trong giai đoạn này có trạng thái hóa học và sinh lý học cơ bản là như nhau, cho nên việc nuôi cấy ở giai đoạn này thường được sử dụng để nghiên cứu sinh hóa học và sinh lý học tế bào. Sinh trưởng logarit là sinh trưởng đồng đều, tức là các thành phần tế bào được tổng họp với tốc độ tương đối ổn định. Nếu cân bằng dinh dưỡng hay các điều kiện môi trường thay đổi sẽ dẫn đến sự sinh trưởng không đồng đều. Sự sinh trưởng khi nhịp độ tổng hợp các thành phần của tế bào tương đối biến hóa sẽ biến đổi theo cho đến khi đạt tới một sự cân bằng mới. Phản ứng này rất dễ quan sát thấy khi làm thực nghiệm chuyển tế bào từ một môi trường nghèo dinh dưỡng sang một môi trường giàu hơn. Tế bào trước hết phải tạo nên các ribosome mới có thể nâng cao năng lực tổng hợp protein, sau đó là sự tăng cưởng tổng hợp protein và DNA. Cuối cùng tất yếu dẫn đến tốc độ phát triển nhanh chóng.
– Pha dừng (Stationary phase): Qua giai đoạn Logarit sự sinh trưởng sẽ dừng lại. Số lượng tế bào cuối cùng quyết định bởi ảnh hưởng chung của điều kiện dinh dưỡng, chủng loại và các nhân tố khác. Trong giai đoạn này, số lượng tế bào sống là không thay đổi, có thể do số lượng tế bào mới sinh ra cân bằng với số lượng tế bào chết đi, hoặc là tế bào ngừng phân cắt mà vẫn giữ nguyên hoạt tính trao đổi chất. Nguyên nhân chủ yếu là sự hạn chế của chất dinh dưỡng. Nếu một chất dinh dưỡng thiết yếu bị thiếu hụt nghiêm trọng thì sự sinh trưởng sẽ chậm lại. Cũng có thể sự sinh trưởng dừng lại khi môi trường có nhiều các sản phẩm trao đổi chất có hại. Sau nữa là, một số chứng cứ cho thấy, khi số lượng tế bào đạt đến một giới hạn nhất định thì sự sinh trưởng có thể bị dừng lại.
– Giai đoạn tử vong (Death Phase): Việc tiêu hao chất dinh dưỡng và việc tích lũy các chất thải độc hại sẽ làm ảnh hưởng đến môi trường sống của tế bào, làm cho số lượng tế bào sống giảm xuống. Đó là đặc điểm của giai đoạn tử vong. Giống như giai đoạn logarit, sự tử vong của tế bào cũng có tính logarit (tỷ lệ tế bào chết trong mỗi giờ là không đổi). Muốn cho tế bào tiếp tục sinh trưởng cần thực hiện các mẻ cấy chuyền với môi trường mới.
4. Khó khăn và tiềm năng của nuôi cấy tế bào động vật
Mặc dù tiềm năng ứng dụng của nuôi cấy tế bào động vật là rất lớn, nhưng việc nuôi cấy một số lượng lớn tế bào động vật thường gặp các khó khăn:
– Các tế bào động vật có kích thước lớn hơn và cấu trúc phức tạp hơn các tế bào vi sinh vật.
– Tốc độ sinh trưởng của tế bào động vật rất chậm so với tế bào vi sinh vật. Vì thế, sản lượng của chúng khá thấp và việc duy trì điều kiện nuôi cấy vô trùng trong một thời gian dài thường gặp nhiều khó khăn hơn.
– Các tế bào động vật được bao bọc bởi màng huyết tương, mỏng hơn nhiều so với thành tế bào dày chắc thường thấy ở vi sinh vật hoặc tế bào thực vật, và kết quả là chúng rất dễ bị biến dạng và vỡ.
– Nhu cầu dinh dưỡng của tế bào động vật chưa được xác định một cách đầy đủ, môi trường nuôi cấy cần bổ sung thêm huyết thanh, rất đắt tiền.
– Hầu hết các tế bào động vật chỉ sinh trưởng khi được gắn trên một bề mặt.
Tế bào động vật thích hợp cho việc sản xuất các phân tử phức tạp và các kháng thể dùng làm thuốc phòng bệnh, điều trị hoặc chẩn đoán. Một vài sản phẩm gene của động vật có vú cũng có thể được sản xuất bởi vi khuẩn bằng cách dùng công nghệ ADN tái tổ hợp. Tuy nhiên, vi khuẩn thiếu khả năng sửa đổi sau dịch mã (post-translational modifications) bao gồm việc phân giải protein, liên kết các tiểu đơn vị (subunit) hoặc nhiều phản ứng kết hợp khác nhau như glycosylation, methylation, carboxylation, amidation, hình thành các cầu nối isulfide hoặc phosphoryl hóa (phosphorylation) các gốc amino acid. Những sửa đổi này rất quan trọng ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học của sản phẩm. Do vậy, tế bào động vật vẫn là một nguồn cung cấp quan trọng, khó có khả năng thay tế trong tương lai gần.
Nguồn: Viện kiểm định quốc gia vaccine và sinh phẩm y tế.
