Nested PCR và những điều cần biết

PCR(Polymerase Chain Reaction) là phương pháp được phát triển vào những năm 1970 và có tính chất cách mạng trong chẩn đoán phân tử. Mục tiêu cơ bản của PCR là khuếch đại một đoạn DNA mục tiêu để tạo ra hàng triệu bản sao của DNA. Điều này được thực hiện dựa trên nguyên tắc khuếch đại một đoạn trình tự DNA đặc hiệu in vitro do sự xúc tác của enzyme DNA polymerase. Sự khuếch đại này được thực hiện nhờ các chu trình luân nhiệt (có thể 20-40 chu kỳ) gồm ba bước cơ bản: Biến tính (Denaturation 95^oC), Bắt cặp (Annealing 40^oC – 70^oC) và Kéo dài (Elongation 72^oC). Trong đó, nested PCR (Nested Polymerase Chain Reaction) là một trong phương pháp biến thể có khả năng gia tăng độ nhạy và độ đặc hiệu.

1. Nested PCR (Nested Polymerase Chain Reaction) là gì?

Nested PCR thường bao gồm hai lần thực hiện PCR truyền thống tuần tự để khuếch đại 1 đoạn gen đích, mỗi phản ứng PCR sẽ sử dụng một cặp mồi khác nhau. Trong phương pháp này, hai cặp mồi PCR được thiết kế: Bộ mồi thứ nhất (mồi ngoài) được thiết kế bao phủ một vùng DNA chứa đoạn trình tự mục tiêu, trong khi bộ mồi thứ hai (mồi trong) được thiết kế gắn đặc hiệu với đoạn trình tự mục tiêu.

Sản phẩm của phản ứng khuếch đại đầu tiên sẽ được sử dụng để làm trình tự khuôn mẫu cho phản ứng PCR thứ hai. Trong trường hợp các sản phẩm không đặc hiệu được khuếch đại do bộ mồi đầu tiên (mồi ngoài), rất khó có khả năng vùng không đặc hiệu này sẽ được bắt cặp và khuếch đại lên bởi bộ mồi thứ hai, vì vậy tính đặc hiệu cuối cùng của phương pháp sẽ được cải thiện so với PCR truyền thống. Một lợi ích khác của Nested PCR là phương pháp này giúp thu được nhiều sản phẩm khuếch đại của đoạn trình tự mục tiêu từ một lượng DNA đầu vào hạn chế (Cải thiện độ nhạy của phản ứng)

2. Ứng dụng của Nested PCR

Như vậy, nested PCR là kỹ thuật làm tăng độ đặc hiệu và độ nhạy khi nhân bản sản phẩm DNA mục tiêu bằng cách thực hiện hai phản ứng tổng hợp. Hiện nay, kỹ thuật này được sử dụng phổ biến trong phân tích phát sinh gene (phylogenetic analysis) hay đa hình di truyền (genetic polymorphism) ứng dụng trong việc phát hiện các gene gây bệnh hay đột biến. Một trong những ứng dụng nested PCR trong phát hiện bệnh truyền nhiễm đó là xét nghiệm bệnh đốm trắng trên tôm (WSSV) trong thời gian ngắn.

Ngoài bệnh trên tôm, nested PCR cũng được nghiên cứu ứng dụng trong việc chuẩn đoán phát hiện và xác định type porcine circovirus type 2 (PCV2) gây ra nhiều hội chứng bệnh ở lợn như hội chứng gầy còm ở lợn sau cai sữa (Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome – PMWS), hội chứng viêm da và viêm thận (Porcine Dermatitis and Nephropathy Syndrome – PDNS), hội chứng viêm đường hô hấp (Porcine Respiratory Diseases Complex) và hội chứng rối loạn sinh sản (Porcine Reproductive Disorders) (Opriessnig, 2007). Nghiên cứu cho thấy phản ứng nested PCR giúp xác định sự có mặt của PCV2 tương ứng với triệu chứng lâm sàng của lợn (có/không có triệu chứng bệnh) (HT Mỹ Lệ, 2012).

3. Hạn chế của Nested PCR và giải pháp khắc phục

Mặc dù Nested PCR là lựa chọn tốt nhất để đạt được độ đặc hiệu, nhưng nó vẫn có một hạn chế lớn đó là rất dễ gây ngoại nhiễm. Khi thực hiện quy trình điện di sau phản ứng PCR thứ hai, bạn bắt buộc phải mở nắp ống sản phẩm của phản ứng PCR thứ hai để tiến hành nạp vào gel điện di. Thao tác mở nắp này, cũng như các bước hút nhả sản phẩm PCR bằng micropipette sau đó chắc chắn sẽ làm phóng thích ít nhiều sản phẩm PCR vào không khí, vì sau hai lần thực hiện PCR hàm lượng sản phẩm khuếch đại cuối cùng là rất lớn. Lượng sản phẩm PCR này sẽ lơ lửng trong không khí suốt nhiều…năm liền và rơi vào những ống phản ứng PCR của những lần chạy kế tiếp, và tất nhiên sẽ gây ra hiện tượng dương tính giả. Việc ngoại nhiễm này sẽ làm hỏng thí nghiệm dẫn đến hao thí thời gian và tiền bạc.

Hiện nay, sự kết hợp giữa các phương pháp phòng ngừa chủ động và thao tác phòng thí nghiệm cận thận có thể giúp ngăn ngừa nguy cơ ngoại nhiễm. Một phương pháp phòng ngừa chủ động được đánh giá rất hiệu quả là sử dụng enzyme UNG (Uracil-DNA glycosidase). Nguyên tắc của giải pháp này là dùng các mix PCR có thêm dUTP và enzyme UNG ngay từ khi sử dụng để khuếch đại sản phẩm ở phản ứng PCR thứ hai, để các sản phẩm khuếch đại cuối cùng sẽ được đánh dấu khác biệt với DNA đích nhờ nhiều vị trí Thymine trên trình tự chuỗi của sản phẩm khuếch đại bị thay thế bởi Uracil do enzyme polymerase nhầm lẫn giữa Thymine và Uracil khi thực hiện khuếch đại.

Chính nhờ vậy, mà sản phẩm khuếch đại cuối cùng nếu bị ngoại nhiễm vào mix mới sẽ không thể tham gia vào phản ứng khuếch đại vì sẽ bị enzyme UNG phá hủy trước khi thực hiện khuếch đại.

4. Trích nguồn

1.Green, M. R., & Sambrook, J. (2019). Nested Polymerase Chain Reaction (PCR). Cold Spring Harbor Protocols, 2019(2), pdb.prot095182. doi:10.1101/pdb.prot095182

2.Wanger, A., Chavez, V., Huang, R. S. P., Wahed, A., Actor, J. K., & Dasgupta, A. (2017). Overview of Molecular Diagnostics Principles. Microbiology and Molecular Diagnosis in Pathology, 233–257. doi:10.1016/b978-0-12-805351-5.00012-0

3.https://www.thermofisher.com/vn/en/home/life-science/cloning/cloning-learning-center/invitrogen-school-of-molecular-biology/pcr-education/pcr-reagents-enzymes/pcr-methods.html#Nested