PHÂN TÍCH BIỂU HIỆN GEN

1. Định nghĩa

Phân tích biểu hiện gen là ứng dụng được sử dụng phổ biến nhất của qPCR. Phân tích biểu hiện gen là nghiên cứu sự phiên mã của RNA bằng cách định lượng RNA trong tế bào.

Định lượng tương đối: Trong điều kiện lượng mẫu đầu vào là như nhau, mẫu có Ct nhỏ hơn thì sẽ có hàm lượng trình tự đích cao hơn. Tuy nhiên trong thực tế thì không có bằng chứng nào để khẳng định lượng mẫu đầu vào là như nhau, vì vậy cần phải có giá trị Ct tham chiếu của gene tham chiếu, việc so sánh sẽ diễn ra gián tiếp thông qua việc so sánh với IC. Đó là nguyên lý của phương pháp định lượng tương đối 2-ΔΔCt của Livak.

Gen tham chiếu: Là gen có mức độ biểu hiện một cách đồng đều trong mọi điều kiện. Thường được dùng để làm cơ sở tham chiếu với gen cần định lượng trong phân tích biểu hiện của gen.

Mẫu đối chứng: là mẫu mang gen tham chiếu đồng thời có điều kiện biểu hiện gen quan tâm trái ngược với mẫu cần nghiên cứu.

Phạm vi ứng dụng

• Định lượng tác nhân đích mà người làm thí nghiệm không thể cân đo đong đếm được lượng để có được số lượng chính xác.
• Định lượng một biển hiện gene nào đó, hay cũng được sử dụng trong định lượng sản phẩm biến đổi gene.

2. Phương pháp nghiên cứu biểu hiện gen 

Trước khi nghiên cứu biểu hiện gen cần cân nhắc các yếu tố sau để set up thí nghiệm định lượng.

• Lựa  loại chất phát huỳnh quang (TaqMan® hoặc SYBR®).
• Lựa chọn một phương pháp phiên mã ngược.
• Lựa chọn multiplex hay singelplex
• Lựa gen tham chiếu.

Các bước thực hiện cơ bản bao gồm:

Bước 1: Tách chiết RNA. Khi tách RNA luôn có lẫn một lượng DNA nhất định ở trong mẫu nên phải loại bỏ lượng DNA này, định lượng Real-time RT-PCR đòi hỏi mẫu RNA tách chiết có độ tinh sạch cao và đặc biệt không bị lẫn DNA [30], nếu mẫu RNA còn lẫn DNA sẽ ảnh hưởng trực tiếp tới kết quả thì nghiệm do DNA sẽ được nhân lên và làm sai lệch định lượng RNA.

Bước 2: Chạy realtime RT-PCR với bộ mồi đặc hiệu với gen đích và gen tham chiếu với mẫu thử (T) và mẫu đối chứng (C).

Bước 3: Tính toán và phân tích kết quả

• Ct(T/Tg): là Ct của gene đích (Tg) trong mẫu thử (T),
• Ct(T/Ref): là Ct của gene tham chiếu (Ref) trong mẫu thử (T)
• Ct(C/Tg): là Ct của gene đích (Tg) trong mẫu chứng (C),
• Ct(C/Ref): là chu kỳ ngưỡng của gene tham chiếu (Ref) trong mẫu chứng (C).

Dựa trên các thông số này, chúng ta sẽ thường hóa (normalized) chu kỳ ngưỡng của gene đích trên mẫu thử (T) và mẫu chứng (C) bằng cách tính hiệu số chênh lệch Ct của gene đích với gene tham chiểu trên các mẫu: 

Mẫu thử:  ΔCt(T) = Ct(T/Tg) – Ct(T/Ref) 

Mẫu chứng:  ΔCt(C) = Ct(C/Tg) – Ct(C/Ref) 

TH1: Hiệu quả PCR của cả hai đều đạt 100%-  phương pháp định lượng tương đối của Livak

Sau đó sẽ thường hóa ΔCt mẫu thử bằng hiệu số chênh lệch ΔCt(T) với ΔCt(C) 

ΔΔCt = ΔCt(T) –  ΔCt(C)

Từ đó tính ra tỷ lệ biểu hiện của gene đích trên mẫu thử so với mẫu chứng, nếu hiệu quả PCR của cả hai đều đạt 100%, là R = 2^–ΔΔCt

Ví dụ: 

Ví dụ sau đây minh họa cho phương pháp định lượng tương đối của Livak áp dụng trong nghiên cứu biểu hiện gene P53 trên cấy tế bào buồng trứng ung thư (T) so với tế bào buồng trứng bình thường (C). Cả hai đều được tách chiết RNA toàn bộ rồi lấy 50 ng RNA được tách chiết để làm thử nghiệm RT real-time PCR với 2 Taqman probe và mồi đặc hiệu cho mRNA của P53 và của gene tham chiếu là GAPDH (các nghiên cứu trước đó chứng minh là GAPDH biểu hiện không khác biệt trên mô bình thường và mô ung thư). Kết quả trình bày trong bảng 8 dưới đây:

Với các kết quả trình bày trong bảng 8 này, chúng ta sẽ tính được:

 ΔCt(T) = Ct(T/Tg) – Ct(T/Ref) = 12.0 – 15.9 = -3.9 

ΔCt(C) = Ct(C/Tg) – Ct(C/Ref) = 15.0 – 16.5 = -1.5 

ΔΔCt = ΔCt(T) – ΔCt(C) = -3.9 – (-1.5) = -2.4

Từ đó tính ra tỷ lệ biểu hiện của P53 trên mẫu thử so với mẫu chứng, nếu hiệu quả PCR của cả hai đều đạt 100%, là R = 2-(-2.4) = 5.3 

Có nghĩa là P53 ở tế bào ung thư biểu hiện gấp 5.3 lần ở tế bào bình thường.

TH2: Hiệu suất PCR ở 2 gen là khác nhau- Phương pháp Pfaffl

3. Chọn gene nào là gen tham chiếu cho lúa ?

Các tiêu chí chọn gen tham chiếu:

– Gen tham chiếu phải là gen có được biểu hiện đồng đều trong các điều kiện sinh trưởng ở cây lúa.

– Gen tham chiếu không nên có mức biểu hiện quá mạnh. Vì khi tiến hành Realtime PCR vối các mẫu có mức biểu hiện cao cần phải pha loãng cDNA để lượng cDNA nằm trong giới hạn định lượng của phương pháp.

Các gen tham chiếu thường được dùng cho cây lúa

-Nghiên cứu về 10 gen tham chiếu : 18S rRNA, 25S rRNA, UBC, UBQ5, UBQ10, ACT11, GAPDH, eEF-1a, eIF-4a, and b-TUB 

-Thực hiện với trong 25 mẫu mô trong các giai đoạn phát triển khác nhau và điều kiện sinh trưởng khác nhau trên cây lúa cho thấy UBQ5 và eEF-1a là ổn định nhất cho việc nghiên cứu biểu hiện gen ở cây lúa. Như vậy ta chọn 1 trong hai gen này làm gen tham chiếu ở cây lúa. 

4. Lựa chọn phương án phiên mã ngược

RT-PCR 2 bước	RT- PCR 1 bước
Dùng trong TH ít mẫu Cần giữ lại mẫu Phát hiện nhiều tác nhân	Nhiều mẫu Chỉ cần phát hiện ít tác nhân Tự động hóa
-Tốt hơn trong việc kiểm soát đầu vào cho PCR -Có thể pha loãng mẫu giúp giảm nồng độ chất ức chế. – Hiệu quả phiên mã ngược tốt hơn PCR 1 bước. – Giữ lại cDNA để dùng sau: ví dụ GTT hoặc phát hiện, định lượng các gen khác.	-RNA cần tinh sạch hơn do RT-PCR 1 bước nhạy cảm với chất ức chế hơn. -Phải tìm điều kiện tối ưu cho cả enzyme phiên mã ngược và enzyme Taq nên hiệu suất không thể cao như RT-PCR 2 bước. Có thể khắc phục nhược điểm này bằng cách tăng thời gian phiên mã ngược và tăng lượng enzyme trong phản ứng.
-Mở nắp nhiều gây nguy cơ nhiễm. -Tiếp kiệm hơn khi cần phát hiện nhiều tác nhân.	-Tránh nhiễm chéo -Chi phí đắt hơn -Tiếp kiệp thời gia
-Dùng mồi oligo d(T)16 hoặc mồi random có thể khuếch đại nhiều loại RNA trong mẫu.	-Dùng mồi đặc hiệu của gen chỉ khuếch đại RNA quan tâm

5.Lựa chọn Multiplex PCR hay singelplex PCR

PCR	Mô tả	Thuận lợi	Hạn chế
Singleplex	Phản ứng trong đó một mục tiêu duy nhất được khuếch đại.	–Không cần tối ưu các điều kiện như sự tương tác giữa các mồi, primer dimer,…. -Linh hoạt sử dụng thuốc thử TaqMan hoặc SYBR Green.	–Yêu cầu 2 phản ứng riêng biệt cho gen mục tiêu và gen tham chiếu
Duplex	Phản ứng trong đó hai mục tiêu được khuếch đại	-Tiết kiệm thời gian và chi phí	– Cần tối ưu về mồi để tránh bắt cặp chéo. – Chỉ dùng với Taqman probe – Có hiện thượng cạnh tranh giữa 2 gen khi cùng khuếch đại trong 1 phản ứng

6. Lựa chọn chất phát huỳnh quang

	Taqman probe	SYBR green
Nguyên lý	Là 1 đoạn nucleotid gắn đặc hiệu với gen mục tiêu	Liên kết với mạch đôi DNA
Độ đặc hiệu	Cao, chỉ bắt vào đoạn gen đặc hiệu	Bắt vào mọi mạch đôi DNA kể cả primer dimer và DNA tổng số trong mẫu
Ưu điểm	-Tín hiệu nền thấp -Giảm khả năng dương tính giảm -Khả năng phát hiện nhiều trình tự gen trong 1 phản ứng	-Linh hoạt khi dùng cho các trình tự khác nhau và không cần thiết kế mẫu dò. – Tiếp kiệm chi phí.
Nhược điểm	-Phải thiết kế mẫu dò cho từng trình tự – Giá thành cao	-Khả năng dương tính giả có thể phát hiện bằng cách chạy đường cong nóng chảy và thiết kế mồi tốt. – Không có khả năng phát hiện nhiều trình tự gen trong 1 phản ứng.

Nguồn: Tổng hợp

===> Mời tham khảo chi tiết sản phẩm theo link: Hãng Solis BioDyne