Phương pháp phát hiện cúm H5N1 trên gia cầm

Tổng quan

Bệnh cúm gia cầm (H5N1) là bệnh do vi rút cúm type A, thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra trên các loài gia cầm, thủy cầm và chim hoang dã. Dựa vào độc lực của vi rút cúm gia cầm người ta xếp loại: bệnh cúm gia cầm độc lực cao, tỉ lệ chết rất cao và cúm gia cầm độc lực thấp với triệu chứng bệnh không rõ rệt và tỷ lệ chết thấp. Vi rút cúm A thuộc subtype H5N1, hệ gen ARN có khả năng biến đổi rất nhanh, tạo ra những chủng, nhánh mới là nguyên nhân gây ra các ổ dịch cúm gia cầm.
Bệnh cúm gia cầm có tính lây truyền rất nhanh và mạnh. Trong đó, thủy cầm là nguồn mang mầm bệnh chính. Gia cầm nhiễm bệnh chủ yếu thông qua tiếp xúc trực tiếp giữa gia cầm mẫn cảm với gia cầm bị bệnh hoặc phân và chất thải của gia cầm bị bệnh. Các loài chim hoang dã cũng bị mắc bệnh và là nguồn lây lan mầm bệnh cho gia cầm và thủy cầm.

Đặc điểm dịch tễ

• Thể độc lực cao

Trên gà: tốc độ lây lan bệnh rất nhanh, tỉ lệ chết có thể đến 100 % trong thời gian 3 ngày đến 4 ngày kể từ khi xuất hiện triệu chứng đầu tiên.
Trên vịt: ngỗng, bệnh ít trầm trọng hơn so với ở gà, tuy nhiên trong một số trường hợp tỉ lệ chết do bệnh trên vịt > 70 % và ngỗng > 50 %.

• Thể độc lực thấp

Bệnh thể độc lực thấp không có biểu hiện rõ rệt, nếu có bệnh thường bị nhầm lẫn với các dạng nhiễm trùng khác. Tỉ lệ chết của cả đàn là 2 % đến 3 % đối với gà và không gây chết trên vịt.

Loại mẫu sử dụng cho xét nghiệm H5N1

Mẫu xét nghiệm kháng nguyên: lấy 3 gam đến 5 gam bệnh phẩm (não, phổi, khí quản, lách, ruột…) của gia cầm bị bệnh. Trong trường hợp gia cầm còn sống, sử dụng tăm bông để ngoáy dịch ổ nhớp (swab), họng hoặc lấy phân tươi sau đó cho vào dung dịch PBS
 

Các phương pháp xét nghiệm

Phân lập virus trên trứng

Vi-rút cúm gia cầm H5N1 thường được phân lập và nhân lên bằng cách cấy các mẫu bệnh phẩm hoặc mô của gia cầm bị nhiễm bệnh vào túi màng đệm của trứng gà đang phát triển. Đây là phương pháp đã được chấp nhận, nhưng đôi khi việc phân lập chỉ có thể thành công khi được cấy vào túi noãn hoàng hoặc lên màng chorioallantoic của trứng gà có phôi. Dịch chorioallantoic được lấy từ trứng có phôi chết hoặc sắp chết và được kiểm tra sự hiện diện của kháng nguyên ngưng kết hồng cầu. Nếu dương tính với ngưng kết hồng cầu, điều này cho thấy chủng phân lập có thể là vi rút H5N1. Sự hiện diện của vi-rút H5N1 có thể được xác nhận bằng xét nghiệm khuếch tán miễn dịch trên gel agar (AGID), RT-PCR dành riêng cho vi-rút H5N1 hoặc bộ xét nghiệm miễn dịch có bán trên thị trường dành riêng cho bệnh cúm H5N1.

Phát hiện kháng nguyên virus (xét nghiệm kháng nguyên)

Xét nghiệm miễn dịch huỳnh quang (cả trực tiếp và gián tiếp) có thể được sử dụng để phát hiện kháng nguyên H5N1 trong mẫu, nhưng phụ thuộc nhiều vào chất lượng mẫu. Mặc dù nhanh chóng nhưng các phương pháp này cũng phụ thuộc vào chất lượng của thuốc thử huỳnh quang và chuyên môn của người trả kết quả xét nghiệm và có độ nhạy thấp. Độ nhạy và độ đặc hiệu của các xét nghiệm kháng nguyên không chỉ phụ thuộc vào kỹ thuật xét nghiệm mà còn phụ thuộc vào các yếu tố như loại mẫu bệnh phẩm được phân tích, chất lượng mẫu bệnh phẩm và thời gian lấy mẫu bệnh phẩm (liên quan đến sự phát tán virus). Dựa trên dữ liệu đã công bố, độ nhạy để phát hiện cúm H1N1 hoặc H3N2 trong các xét nghiệm miễn dịch huỳnh quang là khoảng 70–75% trong khi độ đặc hiệu là khoảng 90–99%. Cần lưu ý rằng độ nhạy của các phương pháp như vậy để phát hiện trực tiếp H5N1 cho đến nay vẫn còn gây thất vọng.         

Kỹ thuật trung hoà vi lượng

Đây là kỹ thuật được đánh giá là nhạy, đặc hiệu nhất trong các phương pháp chẩn đoán huyết thanh học. Nó có khả năng xác định chính xác từng phân týp (H₁N₁, H₃N₂, H₅N₁…) đồng thời có khả năng phát hiện sớm khi nồng độ kháng thể vẫn ở mức thấp mà chưa phát hiện được bằng các kỹ thuật khác. Tuy nhiên kỹ thuật này đòi hỏi có phòng xét nghiệm an toàn sinh học cấp 3.

Phương pháp RT-PCR

Là phương pháp được sử dụng để phát hiện vật liệu di truyền của virus trong đa dạng loại mẫu. Nhằm phát hiện được sự tồn tại của virus H5N1 trước khi chúng gây ra triệu chứng rõ ràng cho vật nuôi. Phản ứng realtime RT-PCR phát hiện vi rút cúm gia cầm trên cơ sở phát hiện các đoạn gen H5 và N1.

Ưu điểm: có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, phát hiện được virus từ sớm.
Nhược điểm: phương pháp xét nghiệm H5N1 bằng PCR hoặc Realtime PCR cần có phòng thí nghiệm đạt tiêu chuẩn để thực hiện các xét nghiệm PCR, giá thành cũng là một vấn đề đối với các nước đang phát triển.

Giải pháp xét nghiệm bệnh ASFV của Công ty TNHH Thiết bị ABT

Công ty TNHH Thiết bị ABT đang cung cấp dòng kit TOPSPEC® H5N1 RT-qPCR Kit để phát hiện RNA Virus bằng kỹ thuật Real-time PCR,  sử dụng hệ mồi – mẫu dò đặc hiệu có độ chính xác cực cao và kết quả có thể đọc trực tiếp trên máy tính trong thời gian ngắn.