Realtime PCR HRM Sử Dụng Dye EvaGreen

1. Giới thiệu

Realtime PCR kết hợp với High-Resolution Melting (HRM) là một phương pháp mạnh mẽ để phân tích sự khác biệt trong trình tự DNA mà không cần sử dụng probe đặc hiệu. Dye EvaGreen là một trong những thuốc nhuộm huỳnh quang được sử dụng phổ biến trong kỹ thuật này do tính đặc hiệu cao, độ nhạy tốt và ít gây ức chế phản ứng PCR.

2. Nguyên lý hoạt động

EvaGreen là một chất nhuộm liên kết với DNA sợi đôi, phát huỳnh quang mạnh khi liên kết với DNA và mất tín hiệu khi DNA biến tính thành sợi đơn. Trong quá trình HRM, DNA được nung nóng dần dần, làm đứt gãy liên kết giữa các sợi, từ đó tạo ra một đường cong tan đặc trưng phản ánh sự khác biệt về trình tự DNA. Sự thay đổi trong nhiệt độ tan (Tm) có thể được phân tích để xác định các biến thể trình tự DNA.

3. Ứng dụng của Realtime PCR HRM sử dụng EvaGreen

• Phát hiện đa hình nucleotide đơn (SNP): So sánh sự khác biệt nhỏ trong trình tự DNA giữa các mẫu.
• Phân biệt kiểu gen: Xác định các biến thể gen một cách nhanh chóng và chính xác.
• Kiểm tra tính thuần chủng của giống cây trồng: Phát hiện sự pha trộn giữa các giống khác nhau.
• Phân tích methyl hóa DNA: Đánh giá mức độ methyl hóa của các trình tự DNA cụ thể để nghiên cứu điều hòa biểu hiện gen.
• Phát hiện đột biến trong ung thư: Xác định sự hiện diện của các đột biến liên quan đến bệnh lý di truyền.
• Kiểm tra vi sinh vật trong thực phẩm và y tế: Xác định các chủng vi khuẩn hoặc virus bằng phân tích trình tự DNA.

4. Quy trình thực hiện

4.1 Chuẩn bị mẫu

• Chiết xuất DNA từ mô, tế bào hoặc mẫu vi sinh vật.
• Định lượng và kiểm tra độ tinh khiết của DNA bằng phương pháp quang phổ hoặc điện di agarose.
• Nếu cần, tiến hành khuếch đại trước bằng PCR.

4.2 Chuẩn bị phản ứng PCR

• Thành phần phản ứng:
  • Buffer thích hợp để tối ưu hoạt động enzyme
  • dNTPs ở nồng độ phù hợp (thường 200 µM mỗi loại)
  • DNA polymerase chịu nhiệt có độ chính xác cao
  • Primer đặc hiệu (thường có chiều dài 18-25 nucleotide, nhiệt độ gắn phù hợp)
  • EvaGreen dye ở nồng độ khuyến nghị
  • Mẫu DNA có nồng độ phù hợp (thường 1-10 ng/reaction)
• Thiết lập chương trình chạy PCR:
  • Biến tính ban đầu: 95°C, 2 phút
  • Chu kỳ khuếch đại (40 chu kỳ):
    • 95°C, 10 giây (biến tính)
    • 60°C, 20 giây (gắn mồi)
    • 72°C, 20 giây (kéo dài)
  • Giai đoạn HRM: Nhiệt độ tăng dần từ 65°C đến 95°C với bước tăng nhỏ (~0.1°C/giây) để phân tích độ tan của DNA.

5. Phân tích kết quả

• Xây dựng đường cong nóng chảy: Độ huỳnh quang giảm dần khi DNA bị biến tính, tạo ra một đường cong đặc trưng.
• So sánh giá trị nhiệt độ nóng chảy(Tm): Các mẫu có trình tự DNA khác nhau sẽ có giá trị Tm khác nhau.
• Nhận diện đột biến hoặc biến thể: Dựa vào sự khác biệt trong đường cong HRM để xác định mẫu có đột biến hay không.

Phân tích dữ liệu HRM thường sử dụng phần mềm chuyên dụng để đánh giá sự khác biệt giữa các mẫu, giúp xác định chính xác các biến thể di truyền hoặc đột biến gen.

6. Ưu điểm của kỹ thuật sử dụng EvaGreen

• Chi phí thấp hơn so với probe đặc hiệu.
• Tính nhạy cao, phát hiện các biến thể nhỏ trong DNA với độ chính xác cao.
• Dữ liệu HRM có thể được sử dụng để phân tích nhiều loại biến thể di truyền khác nhau.
• EvaGreen ít gây ức chế phản ứng PCR, cho kết quả ổn định hơn so với SYBR Green.
• Khả năng tái sử dụng trên nhiều hệ thống máy PCR realtime khác nhau.

7. Kết luận

Realtime PCR HRM sử dụng dye EvaGreen là một phương pháp mạnh mẽ và linh hoạt trong nghiên cứu di truyền và chẩn đoán phân tử. Nhờ vào khả năng phát hiện chính xác các đột biến nhỏ, phương pháp này đang được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khoa học và y học, đặc biệt là trong nghiên cứu di truyền, ung thư, và kiểm tra vi sinh vật.