1. Thế nào là PCR?

PCR (Polymerase Chain Reaction) là kỹ thuật sinh học phân tử nhân bản gene mục tiêu lên hàng triệu lần trong môi trường in vitro dựa vào sự thay đổi nhiệt độ theo chu kỳ, quá trình nhân bản được mô phỏng theo cơ chế của quá trình sao chép DNA trong tế bào (Putra và cộng sự, 2020). Kỹ thuật này có khả năng phát hiện chính xác mục tiêu với lượng mẫu tối thiểu, mà các phương pháp khác như nuôi cấy hoặc huyết thanh học không thể thực hiện được. Độ đặc hiệu và độ nhạy cao của PCR là lý do khiến nó được coi là “tiêu chuẩn vàng” trong các xét nghiệm chẩn đoán bệnh.

Nguyên tắc của kỹ thuật PCR

Cơ sở của PCR là dựa trên quá trình sao chép DNA trong tế bào, cả hai đều là tổng hợp DNA nhưng về đặc tính có sự khác biệt rõ ràng. Sao chép DNA là quá trình sinh học tạo ra hai bản sao DNA giống hệt nhau từ một phân tử DNA ban đầu hay còn gọi là tổng hợp gene in vivo. Quá trình này mang tính liên tục và cần độ chính xác cao, mục đích của sao chép để nhân bản toàn hệ gene cho sự phân chia tế bào. Trong khi đó, PCR là một kỹ thuật sinh học phân tử để tạo ra nhiều bản sao của một đoạn DNA cụ thể ở điều kiện in vitro, kỹ thuật này diễn ra trong thời gian nhất định (theo số chu kỳ) và dễ bị ảnh hưởng từ các thành phần phản ứng cũng như điều kiện bên ngoài.

Thành phần cơ bản một phản ứng PCR bao gồm: DNA khuôn, cặp mồi, DNA polymerase, dNTP và dung dịch đệm. Ống phản ứng sau khi đã đảm bảo đủ các thành phần sẽ đặt vào máy luân nhiệt (hay còn gọi là máy PCR) đã cài sẵn chu trình nhiệt. Quá trình khuếch đại sẽ trải qua các giai đoạn gia giảm nhiệt theo chu kỳ để tiến hành khuếch đại đoạn gene mục tiêu.

2. Thế nào là Real-time PCR?

Vậy thế nào là Real-time PCR? Real-time PCR là kỹ thuật cải tiến từ PCR, cho phép theo dõi sự gia tăng và định lượng DNA mục tiêu trong mẫu thử trong suốt thời gian thực tế diễn ra phản ứng nhờ vào công nghệ phát huỳnh quang (Higuchi và cộng sự, 1993).

Nguyên tắc của kỹ thuật Real-time PCR

Kỹ thuật Real-time PCR (hay Quantitative Polymerase Chain Reaction – qPCR) về cơ bản vẫn là PCR, do vậy nguyên tắc vẫn là dùng cặp mồi đặc hiệu để phát hiện và khuếch đại trình tự mục tiêu bằng cách thay đổi nhiệt độ theo chu kỳ.

Điểm khác biệt đó là Real-time PCR dựa trên việc sử dụng các mẫu dò hay thuốc nhuộm phát huỳnh quang gắn với DNA mục tiêu để chỉ thị sự gia tăng bản sao DNA mục tiêu, lượng tín hiệu ghi nhận được đo trong thời gian thực hiện phản ứng (Mackay, 2004). Theo đó, khi phản ứng nhân bản xảy ra tới một chu kỳ nhất định, cường độ tín hiệu huỳnh quang sẽ bắt đầu có sự gia tăng rõ rệt và tương quan với số lượng bản sao DNA được tạo ra. Kết quả được thể hiện trên máy tính dưới dạng biểu đồ quan sát được qua mỗi chu kỳ, từ đó có thể đưa ra đánh giá về hiệu quả khuếch đại DNA mục tiêu (Hình 2).

Ngoài ra, Real-time PCR yêu cầu có thiết bị đo cường độ phát huỳnh quang từ ống mẫu và cài chương trình phần mềm cho phép xử lý kết quả về sự biến đổi cường độ huỳnh quang.

Hình 2. Quy trình Real-time PCR

3. Sự tương đồng giữa PCR và qPCR

Về bản chất, qPCR chính là PCR được cải tiến, do vậy sẽ có những điểm tương đồng giữa hai kỹ thuật này. Theo đó, cả hai kỹ thuật này đều dùng để nhân bản trình tự gene cụ thể được giới hạn bởi cặp mồi đặc hiệu, giúp phát hiện được tác nhân mục tiêu trong xét nghiệm (định tính). Một điểm tương đồng nữa của hai kỹ thuật này là đều sử dụng DNA làm mẫu đầu vào của phản ứng khuếch đại. Ngoài ra, cả PCR và qPCR đều sử dùng máy luân nhiệt để thay đổi nhiệt độ theo chu kỳ nhằm thực hiện phản ứng nhân bản gene.

4. Sự khác nhau giữa PCR và qPCR

Về nguyên tắc, cả PCR và real-time PCR đều dựa trên sự bắt cặp đặc hiệu giữa cặp mồi và trình tự gene mục tiêu. Tuy nhiên, trong khi PCR chỉ có thể coi kết quả sau khi phản ứng xảy ra hoàn toàn thì phản ứng Real-time PCR có thể theo dõi phản ứng diễn ra theo thời gian thực. Điều này có ý nghĩa quan trọng trong ứng dụng của qPCR, do nó quyết định khả năng định lượng DNA có trong mẫu.

Để thực hiện định lượng được mẫu, qPCR sử dụng thuốc nhuộm huỳnh quang hoặc mẫu dò huỳnh quang có khả năng gắn với trình tự DNA mục tiêu. Về cơ chế, trong phản ứng real-time PCR, các phân tử huỳnh quang gắn với DNA mục tiêu sẽ được hoạt hóa bởi tia laser và kích thích chúng phát ra ánh sáng, sau đó ánh sáng này sẽ được thu nhận bởi các detector của máy luân nhiệt chuyên cho qPCR. Bằng cách đo cường độ tín hiệu huỳnh quang thu nhận được theo thời gian diễn ra phản ứng khuếch đại, hệ thống xử lý tín hiệu sẽ trả ra đồng thời kết quả phát hiện tác nhân mục tiêu (định tính) cũng như định lượng DNA có trong mẫu ban đầu (định lượng).

Về cách thức đọc kết quả, người dùng kỹ thuật PCR chỉ có thể biết được sau khi phản ứng kết thúc. Lúc này kỹ thuật điện di được sử dụng để coi phản ứng khuếch đại có phát hiện được trình tự mục tiêu hay không. Sản phẩm PCR sẽ được quan sát trong gel agarose dưới tác dụng của dòng điện và ánh sáng UV. Cụ thể, DNA tích điện âm sẽ di chuyển về phía cực dương trong gel dưới tác động của điện trường, lúc này phân tử DNA sẽ được phân tách theo khối lượng của chúng. Gel với nồng độ agarose cao sẽ có kích thước lổ nhỏ và được dùng phân tách các phân tử có khối lượng nhỏ, trong khi gel có nồng độ agarose thấp sẽ phân tách được các phân tử có khối lượng lớn hơn do kích thước lổ lớn.

Bên cạnh đó, thang DNA (DNA ladder) được sử dụng là giá trị tham chiếu xác định kích thước của DNA mục tiêu. Sau khi điện di, bản gel chứa DNA sẽ được nhuộm với các thuốc nhuộm (GelRed hay EtBr) và đưa vào máy đọc gel hoặc bàn soi tia UV trong buồng tối để quan sát hình ảnh vạch DNA trên bản gel. Dựa vào kết quả ghi nhận sau điện di sẽ biết được xét nghiệm PCR có phát hiện được tác nhân mục tiêu hay không.

Như vậy nếu sử dụng PCR thì cần thực hiện thêm điện di để đọc được kết quả xét nghiệm. Trong khi đó, đối với real-time PCR, việc đọc kết quả được thực hiện thông qua quan sát biểu đồ cường độ tín hiệu huỳnh quang thu nhận được khi phản ứng diễn ra. Hiện nay các máy luân nhiệt real-time PCR đều kết nối với máy vi tính (hoặc tích hợp chung) để dọc kết quả phản ứng. Điều đó cho thấy real-time PCR tối ưu hơn PCR về tổng thời gian thực hiện, cụ thể đối với PCR sẽ cần 3 đến 4 giờ để chuẩn bị, thời gian diễn ra phản ứng nhân bản và điện di trong khi qPCR chỉ mất khoảng 1,5 đến 2 giờ để hoàn thành. Như vậy bên cạnh các điểm tương đồng, hai kỹ thuật này cũng có các điểm khác nhau riêng biệt được tóm tắt trong Bảng 1.

Bảng 1. Điểm khác nhau giữa PCR và Real-time PCR

	PCR	Real-time PCR
Định nghĩa	Phản ứng phát hiện và nhân bản DNA mục tiêu có trong mẫu (định tính)	Phản ứng phát hiện, nhân bản (định tính) và xác định nồng độ DNA mục tiêu có trong mẫu (định lượng)
Thành phần phản ứng	Cặp mồi đặc hiệu (primer), DNA khuôn (template DNA ), DNA polymerase, PCR buffer	Mẫu dò (probe)/thuốc nhuộm huỳnh quang, cặp mồi đặc hiệu (primer), DNA khuôn (template DNA ), DNA polymerase, PCR buffer
Đọc kết quả xét nghiệm	Sau khi kết thúc phản ứng, sử dụng kỹ thuật điện di để xem vạch DNA trên bản gel	Theo dõi kết quả trong thời gian thực tế diễn ra phản ứng. Xem kết quả từ biểu đồ biểu diễn đường cường độ tín hiệu huỳnh quang trên máy tính
Thời gian thực hiện toàn bộ xét nghiệm	Trong khoảng 3-4 giờ bao gồm: chuẩn bị phản ứng, thực hiện phản ứng và điện di sản phẩm PCR để đọc kết quả trên bản gel	Trong khoảng 1,5 -2 giờ bao gồm: chuẩn bị phản ứng, thực hiện phản ứng và đọc kết quả ngay trên máy tính

5. Đặc điểm nổi trội của Real-time PCR

Như vậy, nhìn chung Real-time PCR khác biệt so với PCR truyền thống ở chỗ kỹ thuật này cho phép theo dõi sự gia tăng bản sao DNA mục tiêu qua mỗi chu kỳ nhiệt độ. Sự tính toán và phân tích dữ liệu từ các tín hiệu huỳnh quang cung cấp thông tin về lượng DNA mục tiêu nucleic acid ban đầu trong mẫu. Điều này tạo ra điểm nổi bật của Real-time PCR so với các xét nghiệm khác đó là cho phép phát hiện và xác định nồng độ DNA mục tiêu có trong mẫu một cách chính xác (độ đặc hiệu cao), đồng thời cung cấp kết quả nhanh chóng ngay khi phản ứng đang diễn ra.

Một ưu điểm nổi bật khác của Real-time PCR là khả năng phát hiện và đo lường DNA mục tiêu trong mẫu ở nồng độ thấp (độ nhạy cao), đồng thời cũng có thể theo dõi được sự biến đổi của chúng theo thời gian. Những điều này làm cho kỹ thuật Real-time PCR trở thành một công cụ quan trọng trong nghiên cứu biểu hiện gene, phát hiện và định lượng các tác nhân gây bệnh truyền nhiễm, phát hiện mầm bệnh trong thực phẩm hay phát hiện và định lượng đột biến.

6. Ứng dụng của qPCR

Real-time PCR ngày nay đã trở thành một kỹ thuật được ứng dụng nhiều trong lĩnh vực chẩn đoán phân tử và nghiên cứu biểu hiện gene. Theo đó, trong chẩn đoán phân tử, kỹ thuật này là công cụ để phát hiện và định lượng gene liên quan đến bệnh tật từ virus, vi khuẩn, ký sinh trùng,… trên cả cho người, thú y, thủy sản, cây trồng, thực phẩm,… Điều này giúp đem lại những lợi ích lớn trong việc chẩn đoán, giám sát và phòng ngừa bệnh tật, đồng thời cung cấp thông tin quan trọng cho nghiên cứu và phân tích dịch tễ học.

7. Vai trò của chẩn đoán Sinh học phân tử

Chẩn đoán Sinh học phân tử trong lĩnh vực Y tế

Về mảng ứng dụng chẩn đoán bệnh trên người, kỹ thuật này được sử dụng rộng rãi trong phát hiện và định lượng gene từ virus gây bệnh như HBV, HCV, SARS-CoV-2, … Nhiều nghiên cứu đã sử dụng Real-time PCR để định lượng gene HBV, HCV trong mẫu máu từ bệnh nhân nhiễm viêm gan (Halfon và cộng sự, 2006; Vermehren và cộng sự, 2008; Kania và cộng sự, 2014). Những nghiên cứu này nhấn mạnh vào việc sử dụng Real-time PCR như một công cụ quan trọng trong chẩn đoán viêm gan và đánh giá tình trạng lây nhiễm.

Chính vì vậy, hiện nay kỹ thuật này đã được ứng dụng phát triển thành các bộ kit được sử dụng rộng rãi trên thị trường. Các bộ kit này cung cấp các công cụ cần thiết để thực hiện quy trình Real-time PCR nhằm phát hiện và định lượng gene của virus HBV, HCV trong mẫu máu hoặc mẫu mô khác trong chẩn đoán, quá trình điều trị cũng như đánh giá tình trạng lây nhiễm của bệnh.

Một ví dụ khác đó là sử dụng Real-time PCR trong phát hiện và định lượng SARS-CoV-2. Nhiều công bố khoa học đã được đưa ra trong thời điểm diễn ra dịch bệnh, trong đó real-time PCR được sử dụng như một công cụ hiệu quả trong nghiên cứu và ứng dụng nhằm ngăn chặn dịch bệnh này (Park và cộng sự, 2020; Chung và cộng sự, 2021; Panchali và cộng sự, 2022). Điều này cho thấy Real-time PCR đóng vai trò quan trọng trong việc xác định các ca nhiễm và giám sát tỷ lệ lây nhiễm trong cộng đồng.

Chẩn đoán Sinh học phân tử trong lĩnh vực Thủy sản, Thú y, GMO

Đối với chẩn đoán bệnh trên thủy sản, thú y, trước đây người dân hay kiểm tra bằng cảm quan như các triệu chứng bên ngoài, nhiệt độ cơ thể, theo dõi sức ăn, hoạt động của vật nuôi, chất lượng môi trường nuôi,… Tuy nhiên các phương pháp này thường không chính xác và khó phát hiện sớm các mầm bệnh. Để hạn chế thiệt hại, việc ứng dụng công nghệ cao trong chẩn đoán, giám sát dịch bệnh là rất cần thiết. Cùng với sự phát triển của kỹ thuật Real-time PCR, các dòng kit ứng dụng kỹ thuật này đang được sử dụng phổ biến trong chẩn đoán và theo dõi hiệu quả điều trị bệnh.

Với lĩnh vực thủy sản, kit Real-time PCR cũng được sử dụng nhằm phát hiện kịp thời các tác nhân gây bệnh phổ biến trong các ao nuôi như virus white spot syndrome (WSSV) gây bệnh đốm trắng ở tôm, virus betanodavirus (VNN) gây bệnh hoại tử thần kinh ở cá. Ngoài ra, nhiều nhà sản xuất đã cung cấp nhiều dòng sản phẩm kit chẩn đoán ứng dụng Multiplex Real-time PCR nhằm phát hiện đồng thời nhiều bệnh trên tôm như bệnh bệnh đỏ thân tôm sú và đỏ dọc thân ấu trùng tôm sú tương ứng do vi khuẩn Vibrio vulnificus và Vibrio alginolyticus gây ra. Như vậy kit real-time PCR được dùng để phát hiện tác nhân gây ra các trên vật nuôi có nguy cơ tử vong cao hoặc nằm trong yêu cầu xét nghiệm để đủ điều kiện xuất nhập khẩu qua các thị trường nước ngoài.

Theo đó, các bộ kit Real-time PCR phát hiện các tác nhân thường gặp trong chăn nuôi như African Swine Fever Virus (ASFV) gây bệnh tả lợn châu Phi, virus gây bệnh cúm A/H5N1 ở gia cầm, ở mảng thú cưng cũng phát hiện các tác nhân như Canine distemper virus (CDV) gây bệnh sài sốt (care) hay Ehrlichia gây bệnh ký sinh trùng máu ở chó, mèo.

Ngoài chẩn đoán sinh học phân tử, Real-time PCR còn được sử dụng hiệu quả trong dán nhãn và xác định hàm lượng GMO. Mỗi tổ chức hay quốc gia sẽ quy định phần trăm GMO để dán nhãn cho mẫu, do đó để giúp doanh nghiệp thực phẩm có thể xuất khẩu vào các thị trường trên thế giới, việc phát hiện sinh vật biến đổi gene là rất quan trọng.

8. Biểu hiện gene

Trong nghiên cứu, phân tích biểu hiện gene nghĩa là xác định mức độ hoạt động gene mục tiêu trong các điều kiện khác nhau. Điều này giúp làm rõ vai trò của các gene trong quá trình phát triển sinh lý và bệnh lý của sinh vật, đồng thời hiểu hơn về cơ chế hoạt động của gene, từ đó ứng dụng trong đánh giá hiệu quả điều trị dựa trên thay đổi biểu hiện gene, và cơ chế tác động của thuốc.

Trong phân tích biểu hiện gene, Real-time PCR được coi là công cụ quan trọng để đo lường được mức độ biểu hiện của gene. Nhiều công bố về ung thư đã thực hiện phân tích biểu hiện gene bằng Real-time PCR. Ví dụ, gene HER2 (Human Epidermal Growth Factor Receptor 2) là một gen quan trọng liên quan đến sự phát triển và tiến triển của ung thư vú (Lohrisch và cộng sự, 2001). Nhiều công bố đã sử dụng Real-time PCR để định lượng mức độ biểu hiện của gen HER2 trong mẫu mô ung thư vú (Nistor và cộng sự, 2006; Mendoza và cộng sự, 2013; Gheni và cộng sự, 2020). Điều này mở ra cánh cửa cho việc phát triển các phương pháp điều trị dựa trên gen HER2, như Herceptin (trastuzumab), một loại thuốc tiêm trực tiếp vào tế bào ung thư vú có biểu hiện HER2 cao.

Một nghiên cứu khác sử dụng real-time PCR để phân tích biểu hiện gene chống stress trong cây Arabidopsis trong việc thích ứng với điều kiện khô hạn. Kết quả nghiên cứu giúp cung cấp thông tin chi tiết về cơ chế phản ứng của cây trong điều kiện môi trường khắc nghiệt, chống lại tác động của môi trường. Nghiên cứu của Zhang và cộng sự (2022) đã sử dụng Real-time PCR để xác định mức độ biểu hiện của gene PCST1 trong Arabidopsis, đây là gene quan trọng trong hệ thống chống lại tác nhân gây stress ở loài cây này. Kết quả nghiên cứu ghi nhận sự biểu hiện quá mức của PCST1 làm tăng tính nhạy cảm với stress NaCl và mannitol ở cây Arabidopsis, cho thấy vai trò quan trọng của gene này trong hệ thống chống stress của cây.

Điều này cho thấy phân tích biểu hiện gene bằng qPCR đóng vai trò quan trọng trong việc xác định mức độ biểu hiện của các gene kháng stress, giúp hiểu rõ hơn về cách cây Arabidopsis đáp ứng và chống lại các tác động của môi trường.

Tài liệu tham khảo

1. Chung, Y. S., Lee, N. J., Woo, S. H., Kim, J. M., Kim, H. M., Jo, H. J., … & Han, M. G. (2021). Validation of real-time RT-PCR for detection of SARS-CoV-2 in the early stages of the COVID-19 outbreak in the Republic of Korea. Scientific Reports, 11(1), 14817.
2. Gheni, N., & Westenberg, D. (2020). Quantitative real-time PCR assay with immunohistochemical evaluation of HER2/neu oncogene in breast cancer patients and its correlation with clinicopathological findings. Indian Journal of Pathology and Microbiology, 63(Suppl 1), S123-S128.
3. Halfon, P., Bourlière, M., Pénaranda, G., Khiri, H., & Ouzan, D. (2006). Real-time PCR assays for hepatitis C virus (HCV) RNA quantitation are adequate for clinical management of patients with chronic HCV infection. Journal of clinical microbiology, 44(7), 2507-2511.
4. Higuchi, R., Fockler, C., Dollinger, G., & Watson, R. (1993). Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions. Bio/technology, 11(9), 1026-1030.
5. Higuchi, R., Fockler, C., Dollinger, G., & Watson, R. (1993). Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions. Bio/technology, 11(9), 1026-1030.
6. Kania, D., Ottomani, L., Meda, N., Peries, M., Dujols, P., Bolloré, K., … & Tuaillon, E. (2014). Performance of two real-time PCR assays for hepatitis B virus DNA detection and quantitation. Journal of virological methods, 201, 24-30.
7. Lawrence Panchali, M. J., Oh, H. J., Lee, Y. M., Kim, C. M., Tariq, M., Seo, J. W., … & Kim, D. M. (2022). Accuracy of real-time polymerase chain reaction in COVID-19 patients. Microbiology Spectrum, 10(1), e00591-21.
8. Lohrisch, C., & Piccart, M. (2001). An overview of HER2. In Seminars in oncology (Vol. 28, pp. 3- Zhang, H., Zhang, K., Liu, T., Zhang, Y., Tang, Z., Dong, J., & Wang, F. (2022). The characterization and expression analysis under stress conditions of PCST1 in Arabidopsis. Plant Signaling & Behavior, 17(1), 2134675.
9. Mackay, I. M. (2004). Real-time PCR in the microbiology laboratory. Clinical microbiology and infection, 10(3), 190-212.
10. Mendoza, G., Portillo, A., & Olmos‑Soto, J. (2013). Accurate breast cancer diagnosis through real-time PCR her‑2 gene quantification using immunohistochemically-identified biopsies. Oncology letters, 5(1), 295-298.
11. Nistor, A., Watson, P. H., Pettigrew, N., Tabiti, K., Dawson, A., & Myal, Y. (2006). Real-time PCR complements immunohistochemistry in the determination of HER-2/neu status in breast cancer. BMC clinical pathology, 6(1), 1-8.11). WB Saunders.
12. Park, M., Won, J., Choi, B. Y., & Lee, C. J. (2020). Optimization of primer sets and detection protocols for SARS-CoV-2 of coronavirus disease 2019 (COVID-19) using PCR and real-time PCR. Experimental & molecular medicine, 52(6), 963-977.
13. Suriady, W., Putra, A. C., Wiyono, W. H., Alatas, M. F., Bermawi, B., Moniqa, R., … & Sumargono, J. E. (2020). An atypical case: RT-PCR-negative, sero-positive covid-19 patient. Pneumologia, 69(2), 107-114.
14. Vermehren, J., Kau, A., Gärtner, B. C., Göbel, R., Zeuzem, S., & Sarrazin, C. (2008). Differences between two real-time PCR-based hepatitis C virus (HCV) assays (RealTime HCV and Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan) and one signal amplification assay (Versant HCV RNA 3.0) for RNA detection and quantification. Journal of clinical microbiology, 46(12), 3880-3891.