Ứng dụng lai điểm ngược (Reverse Dot Blot – RDB) trong định type HPV

Tại sao cần định type HPV

Virus HPV (Human Papilloma virus – HPV) thuộc họ Papillomaviridae được lây truyền qua đường tình dục và những nơi có tiếp xúc trực tiếp hay gián tiếp với nguồn bệnh. Có nhiều hơn 100 type HPV là nguyên nhân gây bệnh liên quan đến bệnh lý da và niêm mạc và khoảng 40 type có tác động lên đường sinh dục, đặc biệt liên quan đến bệnh lý ung thư cổ tử cung. Nhóm được gọi là nguy cơ cao bao gồm các type 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 59, 66 ,68. Trong đó type 16,18 chiếm 70% nguy cơ gây ung thư cổ tử cung, 5% nguy cơ gây ung thư còn lại nằm ở các chủng nguy cơ cao khác. còn lại Các type HPV-6, 11, 42, 43, 44 được gọi là nhóm nguy cơ thấp chỉ gây mụn cóc sinh dục.

Một trong các xét nghiệm sàng lọc ung thư cổ tử cung là xét nghiệm định  type virus HPV. Việc sàng lọc HPV định kì được Hiệp hội Phụ sản Hoa Kì khuyến cáo như sau:

Giới thiệu về lai điểm ngược

Với ưu điểm nổi bật cho phép phát hiện được nhiều đột biến trong cùng một lần thực hiện, phương pháp lai điểm ngược đã được sử dụng trong nhiều nghiên cứu để phát hiện đột biến của 1 loại bệnh như β-thalassemia, đột biến kháng thuốc lao, định type HPV,…  Tại Việt Nam, kỹ thuật này cũng đã được ABT áp dụng để sản xuất bộ TopSENSI® HPV GENOTYPE RDB KIT nhằm xác định sự đồng nhiễm của 32 chủng HPV phổ biến tại việt Nam (Human papillomavirus). Trong đó bao gồm:

Bộ kit có khả năng nhận diện 35 genotype HPV bao gồm:

• 12 genotype HPV nguy cơ cao: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59.

• 10 genotype HPV có khả năng nguy cơ cao: 26, 34, 53, 66, 67, 68, 69, 70, 73, 82.
• 13 genotype HPV nguy cơ thấp: 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 64, 71, 72, 81, 83.

1. Nguyên lý
2. Màng lai

Màng màng nylon Biodyne C tích điện âm. Các nhóm carboxyl trên màng được hoạt hóa bằng EDC (1-ethyl-3-dimethylamino propyl carbodiimide hydrochloride) thành dạng O-acylurea. Dạng chất trung gian này lập tức phản ứng với nhóm amin trên đầu dò oligo thành liên kết amide.

Các nhóm carboxyl sau khi đã được hoạt hóa có thể phản ứng với bất kì tác nhân nào có trong dung dịch. Việc bám không đặc hiệu này thông qua các thương tác tĩnh điện, kị nước hoặc tương tác hóa học đều có thể làm giảm đáng kể độ nhạy của kỹ thuật lai.

 Do đó, đầu dò oligo sau khi đã được cố định trên màng, cần bất hoạt tất cả các nhóm đã hoạt hóa nhưng không gắn oligo. Dung dịch NaOH 0,1 N thường được sử dụng cho quá trình này do tính hiệu quả và đơn giản. Màng sau khi hoạt hóa được bảo quản trong môi trường tránh ẩm.

Đầu dò được cố định trên màng lai là một phân tử axit nucleic sợi đơn có ái lực mạnh với trình tự gen mục tiêu. Đầu dò oligonucleotide gắn đặc hiệu với tự đích. Chiều dài của chúng phù hợp cho phản ứng lai trong các điều kiện ngặt nghèo, giúp phân biệt ADN với những sai khác rất nhỏ trong trình tự. Việc thiết kế đầu dò dựa trên các đặc điểm sau [28]:

– Kích thước phổ biến là 18-30 nucleotide 19

– Thành phần G+C từ 40-60% để tăng khả năng lai đặc hiệu

– Không có các trình tự bổ sung bên trong đầu dò để tránh hình thành cấu trúc “kẹp tóc” (hair-pin), ngăn cản quá trình lai

– Tránh trình tự có nhiều hơn 4 nucleotide lặp lại

– Không sử dụng đầu dò có độ tương đồng >70% với các vùng không phải trình tự đích để tránh hiện tượng lai không đặc hiệu. Đầu dò cho kỹ thuật lai điểm ngược thường được gắn thêm nhóm amin vào đầu 5′.

Sản phẩm PCR

• Sản phẩm PCR đánh dấu với biotin. Trong tự nhiên, tương tác giữa biotin và streptavidin là tương tác sinh học không cộng hóa trị mạnh nhất (hằng số phân ly Kd = 10-15) [17].

Hoạt hóa và cố định đầu dò trên màng nylon Biodyne C

– Rửa màng với dung dịch HCl 0,1 N trong 3 phút

 – Chuyển màng vào dung dịch EDC 16%, lắc nhẹ ở nhiệt độ phòng 15 phút

– Để khô màng ở nhiệt độ phòng

– Đầu dò oligo được pha loãng đến nồng độ tối ưu trong đệm NaHCO3/Na2CO3 0,5 M, pH 8,4

– Chấm 1 µl đầu dò đã pha loãng lên màng, để khô 10 phút

– Cố định bằng NaOH 0,1 N trong 10 phút

– Rửa màng 2 lần với H2O

– Để khô và bảo quản ở 4 oC hoặc dùng màng lai ngay.

Thành phần hóa chất

Nguồn: Tổng hợp

Mời bạn xem thêm sản phẩm tại đây: >>> Kit định type HPV bằng phương pháp RDB <<<

Công ty TNHH Thiết bị ABT chúng tôi luôn tự tin và tự hào với đội ngũ nhân viên có nhiều năm kinh nghiệm về lĩnh vực sinh học phân tử, đặc biệt là các xét nghiệm liên quan đến xét nghiệm bệnh virus, vi khuẩn trên người, thực phẩm, thủy sản, thú y…Nếu có bất kì thắc mắc hay cần trợ giúp, Quý khách hàng vui lòng liên hệ thông tin dưới đây để được hỗ trợ nhanh chóng: