Ứng dụng PCR để phát hiện tình trạng kháng kháng sinh -

Sự gia tăng vi khuẩn kháng kháng sinh (AMR) là một vấn đề toàn cầu vì có rất ít loại kháng sinh có sẵn để điều trị các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn đa kháng thuốc ở người và động vật. Việc phát hiện AMR có thể được thực hiện thường xuyên bằng các phương pháp kiểu hình tiêu chuẩn trên các vi khuẩn có mối đe dọa cho thú y và sức khỏe cộng đồng. Các phương pháp phân tử thường được sử dụng cùng với các phương pháp kiểu hình hoặc được thiết lập để thay thế chúng trong nhiều phòng thí nghiệm vì có thời gian thực hiện ngắn và độ chính xác cao. Đồng thời các phương pháp phân tử cũng mang lại ứng dụng trong việc phát hiện (các) cơ chế di truyền tiềm ẩn đối với AMR. Một số phương pháp phân tử phổ biến hiện đang được sử dụng để phát hiện gen AMR: bao gồm PCR, DNA microarray, giải trình tự toàn bộ bộ gen và metagenomics. Điểm mạnh và điểm yếu của các phương pháp này đang được các nhà nghiên cứu đưa ra và thảo luận, đặc biệt là trong bối cảnh triển khai chúng cho các hoạt động giám sát thường xuyên trên quy mô toàn cầu nhằm giảm thiểu rủi ro do AMR gây ra trên toàn thế giới. Dựa trên mức độ phổ biến hiện nay và tính dễ sử dụng, PCR là phương pháp không thể thay thế được.

Kỹ thuật PCR

PCR là một kỹ thuật được Kary Mullis phát triển vào những năm 1980 và đã cách mạng hóa sinh học phân tử, cho phép khuếch đại nhanh chóng và theo cấp số nhân các chuỗi DNA mục tiêu bằng cách sử dụng mồi PCR tiến và lùi và một enzyme được gọi là DNA polymerase với sự hiện diện của deoxyribonucleotide. Kể từ khi phát triển PCR, đã có một số biến thể cải tiến, bao gồm PCR thời gian thực (Real-time PCR) và khuếch đại đẳng nhiệt,(Ví dụ: LAMP, RPA)

Các xét nghiệm PCR thông thường rất phù hợp để phát hiện sự hiện diện hay vắng mặt của gen (kháng thuốc) nhưng ít phù hợp hơn để phát hiện đột biến điểm trong gen mục tiêu, trừ khi thực hiện giải trình tự Sanger sau đó để phát hiện những đột biến này. Real-time PCR có thể phát hiện các đột biến điểm đơn trong một gen nhất định nếu sử dụng các đầu dò DNA đặc hiệu với trình tự nhắm vào vùng đột biến. Tuy nhiên, phương pháp Real-time PCR là chỉ có thể được sử dụng để phát hiện sự hiện diện của các đoạn DNA ngắn, tối ưu lên tới 150 bp, trong khi PCR thông thường có thể dễ dàng phát hiện các đoạn DNA lớn hơn nhiều.

Kỹ thuật PCR ứng dụng phát hiện gen AMR

PCR được sử dụng phổ biến để phát hiện sự hiện diện của gen AMR trong vi khuẩn phân lập hoặc thậm chí trong các mẫu từ các môi trường khác nhau. Do dễ dàng thiết kế các mồi PCR thông thường, có rất nhiều PCR đã được sử dụng để phát hiện sự hiện diện của các gen AMR khác nhau từ vi khuẩn, ở cả vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí. Một bài báo được trích dẫn nhiều trong lĩnh vực này là của Schwartz et al., người thảo luận về PCR được sử dụng để theo dõi sự hiện diện của vanA (mã hóa kháng vancomycin), mecA (mã hóa kháng methicillin) và ampC (mã hóa kháng ampicillin) trong hệ thống nước thải và màng sinh học nước. Các tác giả đã tìm thấy gen vanA trong cả màng sinh học nước thải và nước uống, trong đó gen vanA được tìm thấy ở màng sinh học nước uống không có vi khuẩn enterococci. Trong khi mecA chỉ được phát hiện trong nước thải bệnh viện thì ampC lại phổ biến nhất và hiện diện trong màng sinh học nước thải, nước bề mặt và nước uống. Một bài báo khác là của Lévesque et al., mô tả PCR được sử dụng để xác định các gen AMR và thứ tự chúng hiện diện trong các vùng gen cassette của các integron.

PCR thông thường cũng đã được sử dụng để phát hiện các gen kháng thuốc ở vi khuẩn trong quá trình nhiễm kháng sinh được sử dụng trong liệu pháp điều trị đầu tiên, chẳng hạn như các kháng sinh liên quan đến kháng beta-lactamase phổ rộng (ESBL). Các xét nghiệm PCR thường được thực hiện cùng với xét nghiệm độ nhạy cảm kháng sinh của các chủng phân lập, kết quả PCR nhanh chóng cho phép thực hiện các biện pháp kiểm soát hoặc điều trị chính xác. Gần đây, cả PCR và Real-time PCR đã được sử dụng rộng rãi trên khắp châu Âu và để giám sát dịch tễ học quy mô lớn đối với các chủng vi khuẩn được lưu trữ để tìm kiếm sự hiện diện của các gen mcr-1 và mcr-2 qua trung gian plasmid. Đối với thuốc kháng sinh cuối cùng như colistin, loại thuốc này đã thu hút nhiều sự quan tâm kể từ khi được phát hiện và báo cáo vào năm 2015. Như đã được chứng minh qua đợt bùng phát kháng colistin, việc sử dụng Real-time PCR như một phương pháp nhanh chóng, dễ dàng và tiết kiệm để nhắm mục tiêu phát hiện gen AMR trong quá trình ứng phó với đợt bùng phát mà không có công nghệ nào khác có thể so sánh được.

Ví dụ về ứng dụng multiplex PCR để phát hiện gen AMR trong các mẫu lâm sàng bao gồm các nghiên cứu của nhóm Strommenger và nhóm Chung, khả năng kháng thuốc của S. aureus kháng đa thuốc đã được xác định bằng phương pháp PCR thông thường và phương pháp multiplex Real-time PCR được sử dụng để phát hiện sự hiện diện của mecA và các gen đặc trưng của loài. Một ví dụ khác là multiplex PCR được sử dụng thường xuyên để giám sát trong các phòng thí nghiệm tham chiếu nhằm phát hiện một số gen ESBL phổ biến nhất: bla TEM, bla SHV, bla CTX-M và bla OXA. Trong một nghiên cứu khác của Randall và cộng sự, multiplex PCR được sử dụng để phát hiện Escherichia coli sinh ESBL có ở lợn tại lò giết mổ ở Vương quốc Anh vào năm 2013 là 23,4%. Các nhà nghiên cứu cũng chỉ ra rằng bla CTX-M là loại ESBL phổ biến nhất có trong các chủng phân lập này. Đồng thời, giải trình tự Sanger của sản phẩm PCR cho thấy CTX-M-1 là biến thể chủ yếu, mặc dù một số CTX-M-15 cũng được phát hiện.

Các xét nghiệm LAMP phát hiện tình trạng kháng thuốc bao gồm một số xét nghiệm đã được phát triển để phát hiện các gen mã hóa tính kháng thuốc kháng sinh trong phương pháp điều trị. Các ví dụ bao gồm các xét nghiệm LAMP được phát triển để phát hiện ESBL, gen AmpC và carbapenemases ở vi khuẩn được phân lập từ cả người và động vật. Do các xét nghiệm LAMP dễ dàng thực hiện ở nhiệt độ không đổi và có thời gian ngắn, một số xét nghiệm LAMP đã được phát triển (bla VIM, bla NDM, bla KPC, họ OXA-48, họ CTX-M-1 và CTX-M -9) để phát hiện carbapenemase và Enterobacteriaceae sinh ESBL bằng hệ thống eazyplex SuperBug CRE (Amplex Biosystems GmbH, Giessen, Đức). Giống như PCR, xét nghiệm LAMP có thể được sử dụng để tìm kiếm sự hiện diện của gen ESBL trong một cộng đồng vi khuẩn thay vì ở các phân lập đơn lẻ. Ví dụ, Kirchner và cộng sự. đã sử dụng xét nghiệm LAMP để xác định sự hiện diện của gen bla CTX-M trong dịch ly giải được tạo ra từ hỗn hợp vi khuẩn có trong môi trường làm giàu qua đêm được chuẩn bị từ mẫu thu thập tại lò mổ.