XÉT NGHIỆM VIÊM GAN B – CHI TIẾT VỀ ĐỊNH LƯỢNG HBV
MỤC LỤC BÀI VIẾT
1. Tổng quan về các xét nghiệm HBV
Virus viêm gan B (HBV) là một trong những mối đe dọa về sức khỏe lớn đối với nhân loại hiện nay. Tình trạng viêm gan mãn tính có thể dẫn đến các biến chứng nghiêm trọng về gan bao gồm xơ gan và ung thư gan từ đó làm tăng nguy cơ tử vong của bệnh nhân. Vì lý do đó, song song với các chương trình tiêm phòng vaccine kháng HBV, các phương pháp xét nghiệm có khả năng phát hiện sự xâm nhiễm và tình trạng xâm nhiễm (cấp tính, mãn tính hay thể ẩn) của HBV là hết sức cần thiết.
Các xét nghiệm HBV được chia thành 2 dạng chính gồm xét nghiệm huyết thanh học (serological diagnosis) và xét nghiệm sinh học phân tử (molecular diagnosis).
Xét nghiệm huyết thanh tập trung vào việc phát hiện các biomarker là các kháng nguyên như HBsAg, HBeAg, HBcAg và các kháng thể của chúng. Dựa trên sự hiện diện của các loại kháng nguyên, kháng thể này, ta có thể phân biệt giữa các trường hợp tiêm vaccine HBV, nhiễm HBV cấp tính, nhiễm HBV mãn tính hoặc đã từng nhiễm HBV.
Trong các loại kháng nguyên và kháng thể, kháng nguyên HBsAg là dạng biomarker được phát hiện đầu tiên và sử dụng phổ biến nhất trong các xét nghiệm chẩn đoán hiện nay. Tuy nhiên, một trong những nhược điểm lớn của phương pháp xét nghiệm HBsAg nói riêng và các xét nghiệm huyết thanh nói chung là việc chúng không có khả năng phát triển các trường hợp nhiễm HBV thể ẩn (do virus mang các đột biến trên vùng epitope của kháng nguyên hoặc ít biểu hiện kháng nguyên trên bề mặt vỏ).
2. Ứng dụng của các xét nghiệm sinh học phân tử đối với HBV
Với tình trạng nhiễm HBV thể ẩn đang tăng dần, xét nghiệm sinh học phân tử bắt đầu được ứng dụng nhiều hơn. Xét nghiệm sinh học phân tử cho HBV phát hiện virus thông qua việc định lượng DNA và xác định kiểu gene (genotype) của chúng.
Định lượng DNA của HBV (HBV DNA) là phương pháp đánh giá hoạt động sao chép và nhân bản của virus từ đó đánh giá tình trạng của bệnh nhân. Tải lượng DNA càng cao đồng nghĩa với diễn tính bệnh càng nhanh và khả năng biến chứng thành ung thư gan càng cao.
Ngoài mục đích giúp xác định giai đoạn bệnh, xét nghiệm DNA còn là một tiêu chí đánh giá để đưa ra liệu pháp điều trị phù hợp với tình trạng của bệnh nhân và đồng thời là đánh giá hiệu quả điều trị của liệu pháp.
3. Các phương pháp xét nghiệm HBV DNA
Phương pháp xét nghiệm DNA rất đa dạng, có thể chia thành 2 dạng chính là dạng trực tiếp và dạng gián tiếp.
► Phương pháp dạng trực tiếp như phương pháp lai (hybridization assay) hoặc phương pháp DNA nhánh (branched DNA) sử dụng các đoạn mẫu dò để nhận diện trực tiếp DNA của virus trong mẫu. Các phương pháp này khá đơn giản, dễ thực hiện và không đòi hỏi nhiều thiết bị phức tạp; tuy nhiên độ nhạy của các phương pháp dạng trực tiếp khá thấp.
► Phương pháp dạng gián tiếp có thể khắc phục được nhược điểm này bằng một bước khuếch đại số lượng một đoạn DNA đặc hiệu ở virus và sau đó ghi nhận tín hiệu. Các phương pháp khuếch đại DNA rất đa dạng như PCR, TMA, LAMP, NASBA,… Các phương pháp này chủ yếu khác nhau về cơ chế khuếch đại (luân nhiệt hay đẳng nhiệt), enzyme sử dụng (DNA polymerase, RNA polymerase, Reverse transcriptase) hay cách thiết kế mồi (bảng 1).
Các phương pháp trên đều có độ nhạy cao và đã được ứng dụng để phát hiện sự xâm nhiễm của nhiều loại virus như HSV, HPV hay HIV, tuy nhiên đối với các xét nghiệm DNA của HBV, các bộ kit thương mại hiện tại chủ yếu vẫn dựa trên phương pháp PCR, và đa số là Real-time PCR để phù hợp cho nhu cầu định lượng.
| Phương pháp | Cơ chế khuếch đại | Enzyme | Mồi |
| PCR/ Real time PCR | Luân nhiệt | DNA polymerase | Đơn giản, ≥ 2 đoạn mồi |
| LCR | Luân nhiệt | DNA Ligase, DNA polymerase | Đơn giản, 4 đoạn mồi |
| TMA | Đẳng nhiệt | Reverse transcriptase, RNA polymerase | Đơn giản, 2 đoạn mồi |
| LAMP | Đẳng nhiệt | Bst DNA polymerase | Phức tạp, 4-6 đoạn mồi |
| NASBA | Đẳng nhiệt | Reverse transcriptase, T7 RNA polymerase, RNAse H | Đơn giản, 2 đoạn mồi |
PCR: Polymerase chain reaction; LCR: Ligase chain reaction; LAMP: Loop mediated isothermal amplification; NASBA: Nucleic acid sequence based amplification; TMA: Transcription mediated amplification;
4. Đo tải lượng HBV bằng Real-time PCR
4.1. Quy trình thực hiện xét nghiệm HBV DNA bằng phương pháp Real-time PCR
Theo quy định của bộ y tế về xét nghiệm HBV (Quyết định số 1868/QĐ-BYT), quy trình xét nghiệm bắt đầu bằng quá trình thu mẫu máu tĩnh mạch từ bệnh nhân, sau đó mẫu được ly tâm để thu lại huyết thanh và được vận chuyển đến cơ sở xét nghiệm để thực hiện tách chiết DNA, đặt phản ứng PCR và phân tích kết quả. Quá trình tách chiết DNA được thực hiện nhằm thu nhận lại DNA của HBV và đồng thời loại bỏ các chất trong mẫu huyết thanh có khả năng ức chế phản ứng PCR như IgG, lactoferrin và một yếu tố kháng virus.
Sản phẩm DNA sau tách chiết được sử dụng là mạch khuôn cho phản ứng PCR. Quá trình PCR cũng cần phân tích các mẫu kiểm soát chất lượng song song với các mẫu thử, các mẫu này bao gồm mẫu chứng dương (kiểm soát quá trình PCR), mẫu chứng âm (kiểm soát tạp nhiễm) và mẫu kiểm soát quá trình tách chiết (thông thường chứng nội bổ sung trước khi tách chiết). Kết quả định tính có thể xác định thông qua giá trị Ct. Tuy nhiên, đa số các bộ kit Real-time PCR cho xét nghiệm HBV là dạng kit định lượng tải lượng DNA virus cho nên quá trình phân tích kết quả sẽ phức tạp hơn.
Ở các bộ kit định lượng, mẫu chứng dương sẽ được thay bằng một dãy các mẫu chuẩn đã biết trước nồng độ DNA. Từ kết quả chạy của các mẫu chuẩn này, ta có thể dựng nên một đường chuẩn biểu diễn tương quan giữa số lượng bản sao DNA và giá trị Ct ở mỗi nồng độ. Dựa trên đường chuẩn đã chạy, số lượng bản sao DNA của virus trong mẫu thử có thể tính được từ giá trị Ct được trả từ thiết bị Real time PCR.
4.2. Phân tích và đọc kết quả Real-time PCR
Nồng độ của HBV ở các mẫu dương tính được tính hoàn toàn dựa trên đường chuẩn được xây dựng từ các chuẩn định lượng.
Kết quả định lượng HBV (IU/ml) được tính toán trên công thức bên dưới
[HBV] (IU/ml): Nồng độ HBV-DNA trong 1mL mẫu.
[KQ] (IU/ml): Kết quả xuất ra từ máy.
V (DNA): Thể tích DNA thu được sau tách chiết (đơn vị μL).
V (mẫu): Thể tích mẫu sử dụng cho tách chiết (đơn vị mL).
Xét nghiệm định lượng virus viêm gan B (HBV DNA) là một phần quan trọng trong chẩn đoán và điều trị viêm gan B. Việc đọc hiểu các chỉ số trong xét nghiệm này cũng góp phần vào quá trình đánh giá mức độ nhiễm virus trong cơ thể bệnh nhân, tình trạng bệnh và đánh giá hiệu quả của liệu pháp, đưa ra phác đồ điều trị phù hợp.
Tài liệu tham khảo:
1. Datta, S., Chatterjee, S., & Veer, V. (2014). Recent advances in molecular diagnostics of hepatitis B virus. World Journal of Gastroenterology: WJG, 20(40), 14615.
2. Song, J. E. (2016). Diagnosis of hepatitis B. Annals of translational medicine, 4(18).
Nguồn bài viết: https://abtvn.com/chi-tiet-ve-do-tai-luong-hbv-bang-real-time-pcr/
