Chẩn đoán lở mồm long móng trong phòng thí nghiệm

Các dấu hiệu lâm sàng điển hình của bệnh lở mồm long móng là sự xuất hiện của mụn nước trên mũi, lưỡi hoặc môi, bên trong khoang miệng, giữa các ngón chân, phía trên móng guốc, trên núm vú. Do đó, bệnh lở mồm long móng khó có thể thể phân biệt trên lâm sàng với các bệnh có dấu hiệu lâm sàng tương tự khác, chẳng hạn như viêm miệng mụn nước, bệnh mụn nước ở lợn và ban đỏ mụn nước. Vì vậy, việc chẩn đoán trong phòng thí nghiệm với các trường hợp nghi ngờ lở mồm long móng là hết sức cần thiết.

1  Lấy mẫu và xử lý mẫu bệnh phẩm

1.1  Lấy mẫu

Mẫu bệnh phẩm: dịch probang, mô cơ tim, biểu mô của mụn nước chưa vỡ hoặc mới vỡ, dịch mụn nước để phát hiện kháng nguyên vi rút

Mẫu biểu mô được sử dụng  trong vòng 7 ngày kể từ ngày lấy mẫu để phát hiện kháng nguyên,. Mẫu bệnh phẩm biểu mô tối thiểu là 2g. Bệnh phẩm  sau khi lấy được bảo quản trong dung dịch bảo quản đệm PBS 0,04 M có bổ sung kháng sinh và Glyxerin 1:1, pH từ 7,2 đến 7,6 ở nhiệt độ âm 20 °C. Máu được lấy lượng tối thiểu là 3 ml, để máu đông tự nhiên, tách lấy huyết thanh, bảo quản ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C.

Mẫu dịch probang được lấy khi mẫu biểu mô không sẵn có từ con vật như trong trường hợp đang hồi phục, hay trường hợp nghi ngờ bệnh lở mồm long móng mà không thể hiện các dấu hiệu lâm sàng. Cho mẫu probang vào ống thu thập mẫu có chứa một lượng môi trường vận chuyển tương đương. Lắc nhẹ hỗn hợp và đảm bảo pH cuối cùng khoảng 7,6.

Mẫu bệnh phẩm được bảo quản trong lọ đựng bệnh phẩm vô trùng, tất cả được đặt trong thùng bảo ôn và vận chuyển trong điều kiện lạnh từ 2 °C đến 8 °C. Mẫu bệnh phẩm gửi đến phòng thí nghiệm trong vòng 24 giờ sau khi lấy, kèm theo phiếu gửi bệnh phẩm, nếu quá thời gian đó, bệnh phẩm phải được bảo quản ở nhiệt độ từ âm 20 °C đến âm 80 °C. Huyết thanh bảo quản ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C tối đa trong 7 ngày. Lưu mẫu bệnh phẩm ở nhiệt độ âm 20 °C (đối với mẫu huyết thanh) và ở âm 80 °C (đối với mẫu bệnh phẩm phát hiện vi rút).

1.2  Xử lý mẫu bệnh phẩm

Mẫu bệnh phẩm là biểu mô của mụn nước được rửa 01 lần với dung dịch xử lý mẫu biểu mô hoặc thấm trên giấy để giảm lượng glycerol, sau đó được nghiền thành huyễn dịch 10 % (ví dụ: 1g biểu mô trong 9 ml dung dịch xử lý mẫu biểu mô). Ly tâm huyễn dịch bệnh phẩm 2500 g trong 15 phút. Thu dịch nổi để chẩn đoán phát hiện vi rút lở mồm long móng bằng phương pháp ELISA, RT-PCR, realtime RT-PCR hoặc phân lập trên tế bào.

2 Các phương pháp chẩn đoán

2.1. Phương pháp phân lập virus

Mẫu biểu mô nên được lấy từ PBS/glycerol, thấm khô trên giấy thấm để giảm hàm lượng glycerol gây độc cho tế bào nuôi cấy và cân. Hỗn dịch nên được chuẩn bị bằng cách nghiền mẫu trong cát vô trùng bằng chày, cối vô trùng kết hợp với một lượng nhỏ môi trường nuôi cấy mô và kháng sinh. Môi trường được thêm vào cho đến khi thể tích cuối cùng gấp chín lần thể tích của mẫu biểu mô được thêm vào, tạo ra huyền phù 10%. Điều này được kiểm tra bằng cách ly tâm ở 2000 rpm trong 10 phút.

Sau khi được huyền phù, các mẫu nghi ngờ có chứa FMDV được cấy vào môi trường nuôi cấy tế bào hoặc vào chuột chưa cai sữa. Các hệ thống nuôi cấy tế bào nhạy cảm bao gồm tế bào tuyến giáp sơ cấp của bò (bê) và tế bào thận sơ cấp của lợn, bê hoặc cừu. Các dòng tế bào đã được thiết lập, chẳng hạn như tế bào BHK-21 (thận chuột đồng con) và IB RS-2, cũng có thể được sử dụng nhưng thường kém nhạy hơn so với các tế bào sơ cấp để phát hiện lượng nhiễm trùng thấp. Độ nhạy của bất kỳ tế bào nào được sử dụng phải được kiểm tra bằng các chế phẩm chuẩn của FMDV. Việc sử dụng các tế bào IB-RS-2 hỗ trợ quá trình phân biệt virus gây bệnh mụn nước ở lợn (SVDV) với FMDV (vì SVDV sẽ chỉ phát triển trong các tế bào có nguồn gốc từ lợn) và thường rất cần thiết để phân lập các chủng vi khuẩn porcinophilic. Các tế bào nuôi cấy nên được kiểm tra hiệu ứng tế bào học (CPE) trong 48 giờ. Nếu không phát hiện thấy CPE, các tế bào nên được đông lạnh và rã đông, được sử dụng để cấy các mẫu cấy mới và kiểm tra CPE trong 48 giờ nữa. Chuột chưa cai sữa là một lựa chọn thay thế cho nuôi cấy tế bào và phải từ 2–7 ngày tuổi và thuộc các chủng cận huyết được chọn lọc

2.2. Phương pháp sắc ký miễn dịch (Test nhanh)

Nguyên lý: Xét nghiệm test nhanh là xét nghiệm dựa trên nguyên lý sắc ký miễn dịch pha rắn nhằm phát hiện định tính kháng nguyên hoặc kháng thể, hoặc cả kháng nguyên – kháng thể hoặc chất/ hợp chất (tùy từng loại sinh phẩm) trong mẫu bệnh phẩm
Ưu điểm: Thao tác đơn giản, dễ thực hiện,  thời gian trả kết quả nhanh chỉ tầm 10-15 phút, giá thành cạnh tranh so với các phương pháp khác.
Nhược điểm: Độ đặc  hiệu của sản phẩm không cao. Kết quả chính xác sau 7-9 ngày kể từ ngày lợn nhiễm bệnh. Khi này các triệu chứng đã thể hiện rõ ràng trên vật nuôi

2.3. Phương pháp ELISA

Mặc dù các phương pháp dựa trên việc phân lập vi rút hoặc chứng minh axit nucleic của virus Lở Mồm Long Móng trong các mẫu mô hoặc chất lỏng hoặc sản phẩm nuôi cấy là đủ để chẩn đoán dương tính, nhưng ELISA vẫn là một trong các phương pháp ưu tiên để phát hiện kháng nguyên vi-rút lở mồm long móng và xác định kiểu huyết thanh của vi-rút trong giai đoạn đầu nghiên cứu. Do thao tác  đơn giản hơn, độ nhạy tốt và độ đặc hiệu cao cũng như ít bị ảnh hưởng nhiều bởi các yêu tố bên ngoài tác động. 

2.4. Phương pháp RT-PCR và Phương pháp realtime RT-PCR

Phương pháp RT-PCR, realtime RT-PCR được sử dụng để khuếch đại các đoạn gen của FMDV trong các vật liệu chẩn đoán bao gồm các mẫu biểu mô, sữa, huyết thanh,… Phương pháp RT-PCR, realtime RT-PCR cho độ nhạy tương đương với phương pháp phân lập vi rút. Các đoạn mồi để xác định kiểu huyết thanh cũng được phát triển và cải tiến từng ngày. Các hệ thống thiết bị thì  ngày càng được đơn giản hóa để sử ngay tại hiện trường.

Ưu điểm: có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, phát hiện được virus từ sớm. RT-PCR và Real-time RT-PCR được tổ chức sức khỏe động vật thế giới (OIE) khuyến cáo sử dụng như một phương pháp tiêu chuẩn để chẩn đoán FMDV
Nhược điểm: phương pháp xét nghiệm FMDV bằng RT-PCR hoặc Realtime RT-PCR cần có phòng thí nghiệm đạt tiêu chuẩn để thực hiện các xét nghiệm PCR

3. Giải pháp chẩn đoán FMDV của công ty TNHH thiết bị ABT

Công ty TNHH Thiết bị ABT đang cung cấp dòng kit TopSPEC® FMDV RT-qPCR KIT để phát hiện RNA Virus bằng kỹ thuật Real-time PCR,  sử dụng hệ mồi – mẫu dò đặc hiệu có độ chính xác cực cao và kết quả có thể đọc trực tiếp trên máy tính trong thời gian ngắn.