Realtime PCR: SYBR® Green so với TaqMan®

Realtime PCR hay còn gọi là qPCR, là một phương pháp được sử dụng rộng rãi để định lượng trình tự DNA mục tiêu trong các mẫu. Phương pháp này được ứng dụng rộng rãi trong xét nghiệm lâm sàng cả định lượng lẫn định tính DNA.

qPCR hoạt động như thế nào

qPCR dựa vào huỳnh quang từ thuốc nhuộm xen kẽ hoặc đầu dò thủy phân để đo khuếch đại DNA sau mỗi chu kỳ nhiệt. Phương pháp dựa trên thuốc nhuộm phổ biến nhất là SYBR Green và phương pháp dựa trên đầu dò phổ biến nhất là TaqMan. Dựa vào tín hiệu huỳnh quang phát ra sau mỗi chu kỳ tương ứng tỷ lệ với số lượng bản sao DNA, kết hợp cùng tín hiệu của các mẫu chuẩn đã biết rõ nồng độ mà chúng ta có thể định lượng được nồng độ DNA mục tiêu trong mẫu ban đầu.

SYBR Green qPCR

Giống như PCR tiêu chuẩn, quy trìnhSYBR Green bao gồm các pha biến tính, ủ và kéo dài. Sự khác biệt là bạn thêm một số thuốc nhuộm liên kết DNA sợi đôi, SYBR Green I, vào hỗn hợp chính của bạn trong quá trình thiết lập qPCR. Thuốc nhuộm huỳnh quang này xen kẽ vào các chuỗi DNA sợi đôi trong pha kéo dài, tại đó nó cho thấy sự gia tăng mạnh mẽ tín hiệu huỳnh quang. Đo tín hiệu này vào cuối mỗi chu kỳ nhiệt sẽ cho phép bạn xác định số lượng DNA sợi đôi hiện có.

Nhược điểm của xét nghiệm SYBR Green là thuốc nhuộm liên kết với bất kỳ trình tự DNA sợi đôi nào. Điều này có nghĩa là bạn cũng có thể phát hiện huỳnh quang phát ra từ các sản phẩm qPCR không đặc hiệu, chẳng hạn như các cặp mồi. Để loại bỏ rủi ro này, có thể kiểm tra tính đặc hiệu của phản ứng bằng cách thực hiện phân tích đường cong nóng chảy hoặc sử dụng phương pháp TaqMan.

TaqMan qPCR

Thay vì sử dụng thuốc nhuộm xen kẽ, xét nghiệm này sử dụng đầu dò TaqMan với đầu Reporter 5′ và đầu Quencher 3′. Các đầu dò này là đặc hiệu với mục tiêu và chỉ liên kết với trình tự DNA quan tâm ở cuối của một trong các đoạn mồi trong bước gắn. Khi enzyme Taq polymerase gặp đầu dò TaqMan trong giai đoạn kéo dài, nó sẽ đẩy và cắt đầu Reporter 5′. Sau khi đầu Reporter được tách khỏi Quencher, tín hiệu huỳnh quang có thể đo được của nó ở cuối mỗi chu kỳ qPCR tăng lên đáng kể. Chuỗi DNA thứ hai được tổng hợp song song nhưng vì không có đầu dò nào được gắn vào nó nên quá trình này không thể được theo dõi bằng các phép đo huỳnh quang.

So với xét nghiệm SYBR Green, việc sử dụng đầu dò TaqMan đắt hơn nhưng cũng mang lại hai lợi thế đáng kể:

• Xét nghiệm TaqMan chỉ đo sự tiến triển khuếch đại của chuỗi mục tiêu vì các đầu dò có tính đặc hiệu với mục tiêu.
• Bạn có thể theo dõi số lượng các sản phẩm qPCR khác nhau trong một phản ứng duy nhất bằng cách thêm các mồi khác nhau và đầu dò TaqMan với các thuốc nhuộm báo cáo khác nhau vào hỗn hợp chính. Phương pháp ghép kênh này cho phép bạn phát hiện một số tín hiệu huỳnh quang vào cuối mỗi chu kỳ nhiệt.