Hiểu đúng khái niệm trong Realtime PCR để đọc kết quả dễ dàng hơn

Xét nghiệm bằng phương pháp Realtime PCR ngày càng trở nên phổ biến trong lĩnh vực sinh học phân tử.

Để dễ dàng hơn khi đọc kết quả của kĩ thuật Realtime PCR, ABT xin chia sẻ đến Quý Khách hàng một số khái niệm cơ bản trong quá trình khuếch đại tín hiệu huỳnh quang như sau:

Background: là tín hiệu huỳnh quang nền được tạo thành không liên quan đến realrime PCR. Tín hiệu này thường do đầu reporter của Probe phát ra, về lý thuyết thì ở điều kiện bình thường quencher sẽ hấp thụ hết tín hiệu do reporter phát ra, nhưng thực tế không phải vậy, quencher không thể hấp thụ 100% tín hiệu do reporter phát ra nên trong hầu hết các phản ứng realtime  PCR đều xuất hiện tín hiệu nền.

Ngoài ra, mỗi loại probe khác nhau, hãng tổng hợp khác nhau thì tín hiệu nền của từng probe sẽ khác nhau. Ngày nay, các hãng tổng hợp probe cũng đã thiết kế ra nhiều cách để hạn chế tín hiệu nền này như dual quencher,…

Baseline: là mức độ tín hiệu trong suốt những chu kỳ đầu của realtime PCR (3-15 Ct), với sự thay đổi ít về cường độ tín hiệu huỳnh quang.

Những chu kỳ đầu của realtime, nồng độ ban đầu của mẫu thấp nên cường độ huỳnh quang phát ra quá thấp để máy realtime có thể ghi nhận được và giai đoạn này thường chỉ ghi nhận được tín hiệu nền của mẫu.

Thông thường giá trị Baseline được cài đặt trong khoảng 3-15 Ct, nhưng trong một số trường hợp tín hiệu mẫu không như mong muốn các bạn có thể cài lại để phân tích kết quả dễ dàng và chính xác hơn. Chú ý giá trị baseline end phải trước đường tín hiệu khuếch đại sớm nhất 1-2 Ct.

Threshold: là mức tín hiệu mà ở đó nó phản ánh sự gia tăng tín hiệu có ý nghĩa về mặt thống kê, giúp phân biệt tín hiệu khuếch đại khỏi tín hiệu nền. Người ta thường thiết lập giá trị Threshold dựa vào đường nền hoặc mức tín hiệu thực tế của mẫu. Cách thiết lập giá trị Threshold tương tự như baseline.

Một số hãng máy realtime cho phép điều chỉnh đường baseline để ghi nhận giá trị Ct của mẫu, còn một số hãng khác lại cho phép điều chỉnh giá trị Ct dựa vào giá trị Threshold. Tùy từng thiết bị sẽ có chế độ mặc định Threshold khác nhau. Để điều chỉnh giá trị threshold đúng theo từng phản ứng bạn nên điều chỉnh thủ công dựa vài dữ liệu thô của máy thay vì để chế độ Auto.

Nếu điều chỉnh giá trị threshold quá thấp, kết quả sẽ rất dẽ thu nhận tín hiệu nhiễu, nếu điều chỉnh giá trị threshold quá cao, kết quả sẽ có độ chính xác thấp vì bỏ qua các mẫu dương yếu. Theo các hãng khuyến cáo, bạn nên điều chỉnh giá trị threshold khoảng 5% so với giá trị tín hiệu huỳnh quang cao nhất của mẫu. Theo kinh nghiệm của mình là điều chỉnh giá threshold  đầu hoặc giữa pha Log của mẫu, khi đó giá trị Ct ghi nhận được sẽ chính xác nhất. Để biết chính xác các pha trong realtime mời Quý khách tham khảo thêm hình bên dưới hoặc các bài viết về PCR và Realtime PCR của chúng tôi!

Ct (threshold cycle): Là số chu kỳ mà ở đó tín hiệu huỳnh quang của phản ứng vượt lên cắt đường ngưỡng, thay đổi từ âm tính (không thể phát hiện được) sang dương tính (có thể phát hiện được). Giá trị chu kỳ ngưỡng (Ct) phản ánh lượng gene quan tâm trong giai đoạn đầu của phản ứng và tỷ lệ nghịch với mức biểu hiện tương đối ban đầu của gen quan tâm. Nếu giá trị Ct càng nhỏ có nghĩa là nồng độ gene quan tâm ban đầu càng lớn và ngược lại.

Passive reference dyes: thường được sử dụng trong realtime PCR để chuẩn hóa tín hiệu huỳnh quang của Reposter và hiệu chỉnh sự dao động về tín hiệu huỳnh quang không tạo thành do PCR giữa các giếng. Không phải máy Realtime PCR nào cũng có chế độ này, nên trước khi sử dụng bạn nên xem kỹ thông tin của máy hoặc có thể hỏi nhà cung cấp để chọn loại hóa chất chạy máy sao cho phù hợp.

The cycle cut-off value: Là giá trị ngưỡng kỹ thuật, giá trị này thường được xác định đối với xét nghiệm định tính, dựa vào giới hạn phát hiện của phương pháp xét nghiệm (LOD). Trước khi sử dụng 1 phương pháp Realtime PCR trong xét nghiệm, cần phải xác định khoảng tuyến tính của phương pháp dựa trên giới hạn trên và giới hạn dưới của phương pháp. Giới hạn dưới là nồng độ tối thiểu mà phương pháp có thể phát hiện được 1 cách chính xác, dựa vào đây người ta sẽ thiết lập giá trị Ct cut-off .

Thông thường các chu trình nhiệt của 1 phản ứng Realtime PCR sẽ được cài đặt từ 40-45 chu kỳ. Những mẫu xuất hiện Ct được coi là dương tính, không xuất hiện Ct được coi là âm tính. Các kit xét nghiệm trên thị trường hiện nay thường có giá trị Ct Cut-off trong khoảng 35-37, Những mẫu nào có giá trị Ct nhỏ hơn hoặc bằng giá trị Ct cut-off được coi là có độ tin cậy cao, còn mẫu nào có giá trị Ct lớn hơn Ct cut-off được coi là nghi ngờ cần chạy lại để xác định hoặc kết luận âm tính.

Các mẫu dương tính muộn có Ct từ 38-45, được đánh giá là dương tính giả hoặc nồng độ quá thấp bộ kit không thể phát hiện được, nguyên nhân có thể do sự bắt cặp không đặc hiệu, nhiễm chéo hoặc sự thoái hóa của Tag polymerase, probe,…

Hy vọng thông qua bài viết này, các bạn sẽ có thêm kiến thức để phân tích kết quả Realtime PCR một các chính xác và dễ dàng hơn.

Mời Quý khách tham khảo thêm bài viết hướng dẫn lựa chọn máy Realtime PCR: >>> Những điều cần biết khi lựa chọn máy Realtime PCR tại Việt Nam <<<

Nguồn: Tổng hợp

Công ty TNHH Thiết bị ABT chúng tôi luôn tự tin và tự hào với đội ngũ nhân viên có nhiều năm kinh nghiệm về lĩnh vực sinh học phân tử, đặc biệt là các xét nghiệm liên quan đến xét nghiệm bệnh virus, vi khuẩn trên người, thực phẩm, thủy sản, thú y…Nếu có bất kì thắc mắc hay cần trợ giúp, Quý khách hàng vui lòng liên hệ thông tin dưới đây để được hỗ trợ nhanh chóng: